姜黃素預處理對干熱環(huán)境大鼠骨骼肌組織學及超微結(jié)構(gòu)變化的影響*

張東輝 薛曉玉 謝 志 唐 軍 李建瑛 許 琴是文輝 李佳佳 董 翔 馬 娜 宋來陽 劉江偉

(新疆軍區(qū)總醫(yī)院新疆特殊環(huán)境醫(yī)學重點實驗室，烏魯木齊 830000)

肌纖維類型最早發(fā)現(xiàn)于1673年，Loranzini 認為動物骨骼纖維有紅色與白色之分；隨后，Ranvier 在 1883 年正式提出紅色的骨纖肌(簡稱紅肌)和白色的骨纖肌(簡稱白肌)功能 有所不同，并利用電刺激方法證明了這一理論。近期研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)高溫應激可以誘導紅肌纖維向白肌纖維轉(zhuǎn)化。對于在41 ℃干熱環(huán)境中大鼠的骨骼肌是否也會出現(xiàn)紅肌轉(zhuǎn)化為白肌的熱應激反應，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)姜黃素(curcumin)能夠延長沙漠干熱環(huán)境中暑大鼠的生存時間[1]。我們推測姜黃素在大鼠骨骼肌熱應激反應中能夠起到一定作用。本次研究主要觀察在姜黃素作用下沙漠干熱環(huán)境中大鼠骨骼肌組織學和超微結(jié)構(gòu)的變化，為姜黃素在干熱環(huán)境中暑的防治應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及實驗環(huán)境

新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心提供6～8周齡雄性SPF級SD大鼠200只，體質(zhì)量220～260 g，實驗動物生產(chǎn)合格證號[SCXK(新)2011-0001]。大鼠自購入后于新疆軍區(qū)總醫(yī)院實驗動物科SPF環(huán)境獨立通氣籠中適應性飼養(yǎng)一周，飼養(yǎng)環(huán)境保持溫度25 ℃，相對濕度45%，飼料經(jīng)輻照處理，飲水經(jīng)高溫滅菌處理，大鼠自由攝食和飲水。

1.2 儀器與試劑

西北特殊環(huán)境人工實驗艙(新疆軍區(qū)總醫(yī)院研制)、全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司,BS-180)、電子稱(上海儀器廠，精確度:0.1 g、量程:1 000 g)、分析天平(上海儀器廠，精確度:0.1 mg、量程:220 g)、BI2000醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)。姜黃素(東京化工業(yè)株式會社，天然物(CI-75300))、羧甲基纖維素鈉(上海源葉生物科技有限公司，300-800mpa.s)，肌紅蛋白測定試劑盒(北京利得曼生化技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號：201501071)

1.3 實驗分組

將200只健康雄性大鼠隨機分為5組： ①對照組(鹽水組)：正常飼喂，不做預處理；②羧甲基纖維素鈉溶劑組(溶劑組)：用5 g羧甲基纖維素鈉+蒸餾水定容到1 000 mL配成0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液；③姜黃素低劑量預處理組：用姜黃素5 mg/100 g+0.5%羧甲基纖維素鈉溶液④姜黃素中劑量預處理組：用姜黃素10 mg/100 g+0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，⑤姜黃素高劑量預處理組：用姜黃素20 mg/100 g+0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。以上各組按照1 mL/100 g體質(zhì)量灌胃，連續(xù)灌胃7 d，1次/d。

1.4 模型建立及取材方法

特殊環(huán)境人工實驗艙內(nèi)將沙漠干熱環(huán)境設定為(41±0.5)℃，相對濕度(10±1)%，大鼠進艙前，禁食12 h，可隨意飲水。大鼠進艙后禁食禁水，不麻醉，可在籠內(nèi)自由活動。按0 min、50 min、100 min、150 min時間點從艙中取出大鼠，腹腔注射3%戊巴比妥鈉，麻醉大鼠，剪開腹腔，下腔靜脈采血，用于肌紅蛋白檢測；取部分股二頭肌置于4%中性甲醛液中固定、脫水、包埋、切片、HE染色、普通顯微鏡下觀察，描述組織病理變化；于50 min、150 min由鹽水組、姜黃素高濃度組大鼠股二頭肌中取1 mm×1 mm×1 mm組織塊置于鋨酸中固定、脫水、浸透、包埋、切片、染色、透射電鏡觀察。

1.5 肌紅蛋白檢測方法

肌紅蛋白檢測使用全自動生化分析儀進行測定，具體參數(shù)按試劑盒要求設定。

1.6 灰度測量方法

1.7 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 干熱環(huán)境鹽水組、姜黃素高濃度組大鼠骨骼肌組織學觀察

鹽水組、姜黃素高濃度組0 min時肌纖維染色均勻，部分肌纖維橫紋不清晰，肌纖維側(cè)面細胞核排列整齊，核仁清晰，有少量肌纖維部分區(qū)域呈灰紅色，此區(qū)域橫紋較為清晰，與周圍相比兩側(cè)胞核數(shù)量較多(圖1 A,B)。50 min鹽水組肌肉縱切面紅肌變淡，部分呈片集中分布，部分散在分布于紅肌中(圖1C)；姜黃素高濃度組部分紅肌局部顏色變淡，且分布較為分散(圖1D)。100 min鹽水組肌肉縱切面同一根肌纖維中仍保持部分紅肌，部分呈現(xiàn)白肌且顏色明顯變淡，同一視野下轉(zhuǎn)化白肌的肌纖維數(shù)量明顯增多(圖1E)；姜黃素高濃度組肌肉縱切面同一根肌纖維中局部出現(xiàn)白肌，但顏色仍呈現(xiàn)淡紅色，同一視野下轉(zhuǎn)化白肌的肌纖維數(shù)量相對較少(圖1F)。150 min鹽水組肌肉縱切面肌纖維中白肌比例明顯增高，只有少部分肌纖維邊緣含有紅色(圖1G)；姜黃素高濃度組肌肉縱切面轉(zhuǎn)化白肌的肌纖維數(shù)量有所增多，但顏色仍呈現(xiàn)淡紅色(圖1H)；150 min鹽水組肌肉橫切面肌束中多數(shù)肌纖維呈現(xiàn)白色，只有肌束邊緣少數(shù)肌纖維保持紅色(圖1I)；姜黃素高濃度組肌肉橫切面肌束中間部分肌纖維顏色變淡，肌束邊緣多為紅色肌纖維(圖1J)。

圖1 干熱環(huán)境大鼠骨骼肌組織學變化注：A, 0 min鹽水組;B, 0 min姜黃素高濃度組;C, 50 min鹽水組;D,50 min姜黃素高濃度組;E, 100 min鹽水組;F, 100 min姜黃素高濃度組;G, 150 min鹽水組;H, 150 min姜黃素高濃度組;I, 150 min鹽水組肌肉橫切面;J, 150 min姜黃素高濃度組肌肉橫切面Fig.1 Histological changes of rats skeletal muscle in dry heat environmentNote:A, 0 min saline group;B, 0 min high dose curcumin pretreatment group;C, 50 min saline group;D, 50 min high dose curcuminpretreatment group;E, 100 min saline group; F, 100 min high dose curcumin pretreatment group; G, 150 min saline group;H, 150 min high dose curcumin pretreatment group; I, 150 min saline group (transverse section of muscle);J, 150 min high dose curcumin pretreatment group(transverse section of muscle)

2.2 干熱環(huán)境鹽水組、姜黃素高濃度組大鼠骨骼肌電鏡觀察

在干熱環(huán)境50 min時鹽水組骨骼肌肌纖維中部分線粒體濃縮變小甚至消失，線粒體數(shù)量明顯減少，Z線排列較為整齊；(圖2A)姜黃素高濃度組骨骼肌肌纖維中部分線粒體濃縮變小甚至消失，局部線粒體數(shù)量有所減少，但在肌纖維邊緣部分區(qū)域線粒體堆集，有增生跡象(圖2B)。在干熱環(huán)境150 min時鹽水組骨骼肌肌纖維中線粒體數(shù)量非常少，部分Z線排列不整齊，胞核膜和核仁較為清晰(圖2C)；姜黃素高濃度組骨骼肌肌纖維中部分線粒體濃縮變小甚至消失，部分線粒體腫脹模糊，局部線粒體數(shù)量有所減少，但在肌纖維部分區(qū)域線粒體堆集，有增生跡象，部分Z線排列不整齊(圖2D)。以上結(jié)果表明干熱環(huán)境鹽水組以線粒體減少為主要組織學改變；姜黃素高濃度組線粒體與鹽水組相比減少數(shù)量較少，另外無論在干熱環(huán)境50 min還是150 min均可見線粒體堆集的增生跡象。

圖2 干熱環(huán)境大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)變化注：A，50 min鹽水組；B，50 min姜黃素高濃度組；C，150 min鹽水組；D，150 min姜黃素高濃度組Fig.2 Ultrastructural changes of rats skeletal muscle in dry heat environmentNote: A，50 min saline group; B，50 min high dose curcumin pretreatment group; C，150 min saline group;D，150 min high dose curcumin pretreatment group

2.3 干熱環(huán)境大鼠血液中肌紅蛋白含量的測定

結(jié)果顯示干熱環(huán)境大鼠血液中肌紅蛋白含量各組比較相差不顯著(P>0.05)。說明未出現(xiàn)肌纖維破裂而導致肌紅蛋白進入血液中導致血液中濃度增高的現(xiàn)象，表明肌纖維完整性較好。見表1.

表1 干熱環(huán)境大鼠血液中肌紅蛋白(ng/mL)測量結(jié)果Table 1 Measurement of myoglobin (ng/mL) in theblood of rats in dry heat environment

2.4 姜黃素對干熱環(huán)境大鼠骨骼肌白肌含量的影響

鹽水組和溶劑組，從0 min到150 min，灰度值逐漸升高，150 min明顯高于0 min組(P<0.05)，在各個時間點(0 min除外)，隨著姜黃素濃度增加，灰度值均呈下降趨勢，在50 min組差異無顯著性(P>0.05)，在100 min和150時，姜黃素中、高濃度組灰度值較溶劑組和鹽水組差異明顯，具有顯著性差異(P<0.05)。

表2 干熱環(huán)境大鼠骨骼肌白肌灰度測量結(jié)果Table 2 Measurement of gray scale of rats skeletal musclein dry heat environment

注： 150 min中濃度組、高濃度組與鹽水組和溶劑組比較★P<0.05；100 min中濃度組、高濃度組與鹽水組和溶劑組比較※P<0.05；鹽水組0 min與150 min比較，*P<0.05)；溶劑組0 min與150 min比較，#P<0.05。

Note： At dry heat 150 min, medium and high dose curcumin group compared with saline and solvent group,★P<0.05；At dry heat 100 min, medium and high dose curcumin group compared with saline and solvent group,※P<0.05；In the saline group, Omin group compared with 150 min group *P<0.05; In the solvent group, Omin group compared with 150 min group#P<0.05

3 討論

骨骼肌是人和動物軀體的重要組成部分，根據(jù)骨骼肌肌纖維顏色的不同，將其分為紅肌與白?。欢鶕?jù)骨骼肌肌纖維收縮特性 將其分為慢肌與快??；在這種分類方法中，紅肌實際上對應于慢肌，白肌對應于快肌。根據(jù)肌球蛋白 ATP 酶在不同酸堿環(huán)境中活性的差異，可將骨骼肌肌纖維分為 I、IIa、IIb 三種類型[2-3]，其中I型對應紅色的慢??；II型對應于白色的快肌。I 型纖維含有豐富的線粒體，表現(xiàn)出氧化代謝功能；II 型纖維含有的線粒體較少，但糖原酵解能力強。骨骼肌肌纖維類型并不是一成不變，它們會在一定條件下發(fā)生轉(zhuǎn)變。其中高溫應激可誘導Ⅰ型肌纖維向Ⅱ型肌纖維的轉(zhuǎn)化[4-6]。本次研究發(fā)現(xiàn)在干熱環(huán)境中隨著時間延長鹽水組、溶劑組、低濃度組大鼠骨骼肌紅肌減少，白肌增多(P<0.05)，而且白肌肌纖維橫紋清晰、結(jié)構(gòu)完整，肌纖維中線粒體明顯減少，未發(fā)現(xiàn)肌纖維損傷和炎性細胞，同時血液中肌紅蛋白含量未見明顯變化(P>0.05)，表明本次研究中大鼠骨骼肌紅肌減少，白肌增多是一種生理改變的現(xiàn)象，這是高溫應激誘導的結(jié)果。值得注意的是姜黃素干預組的中濃度組和高濃度組大鼠骨骼肌紅肌未見明顯減少，白肌未見明顯增多(P>0.05)，肌纖維中線粒體數(shù)量降低較少，局部有線粒體堆集增生的跡象。表明經(jīng)過姜黃素預處理后，在高溫應激反應中能夠抑制Ⅰ型肌纖維向Ⅱ型肌纖維的轉(zhuǎn)化。

近期在肌纖維類型轉(zhuǎn)化研究中發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體增殖受體γ輔激活因子(peroxisome proliferators-activated receptorγcoactivator 1alpha，PGC-1α)和AIMP1(ARS-interacting multifunctional protein 1, AIMP1)又稱 p43 蛋白，均能夠促進Ⅰ型肌纖維(紅肌)類型屬性的形成[7-9]，并且發(fā)現(xiàn)PGC-1α和AIMP1在骨骼肌中高度表達，參與了能量代謝、線粒體合成、肌纖維轉(zhuǎn)換等[10-11]。本次研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過姜黃素預處理后，姜黃素高濃度組線粒體與鹽水組相比減少數(shù)量較少，另外無論在干熱環(huán)境50 min還是100 min均可見線粒體堆集增生跡象；我們在前期研究中也發(fā)現(xiàn)經(jīng)過姜黃素預處理后的大鼠在干熱環(huán)境中肝臟、腎臟的線粒體損傷較小，形態(tài)較為完整[12-13]；另外在藥效研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用，而氧化應激、炎癥反應，甚至腫瘤的產(chǎn)生都與細胞線粒體損傷有關。這些研究結(jié)果表明姜黃素對細胞線粒體具有一定的保護作用。那么姜黃素是直接作用于細胞線粒體還是間接的通過對PGC-1α和AIMP1之類有利于線粒體保護的因子起作用還需進一步探討。

綜上所述，本研究中姜黃素預處理可以減少干熱環(huán)境骨骼肌從紅肌轉(zhuǎn)向白肌的數(shù)量，并對骨骼肌線粒體的減少具有一定的抑制作用，骨骼肌白肌可能是骨骼肌應激狀態(tài)的代償狀態(tài)，伴隨無氧酵解能力的增強。但隨著應激因素的持續(xù)作用最終可能超出代償能力而發(fā)生橫紋肌溶解，本組中沒有發(fā)現(xiàn)骨骼肌溶解，肌紅蛋白不高，可能因為干熱環(huán)境的大鼠處于靜止狀態(tài)，沒有附加勞力型運動等應激因素，勞力型熱射病常發(fā)生在熱環(huán)境下作業(yè)和軍事及體育運動者，橫紋肌溶解常常是勞力型熱射病的過程中導致多臟器功能障礙的重要因素[14]，本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠穩(wěn)定骨骼肌線粒體數(shù)量，阻止骨骼肌代償?shù)氖Ш鉅顟B(tài)。因此我們推測，姜黃素預處理可能在對于干熱環(huán)境下勞力型熱射病并發(fā)的橫紋肌溶解及繼發(fā)的多臟器功能障礙具有一定的抑制作用，在臨床上具有重大的應用價值，值得進一步探索和研究。