CDK4和CDK6在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及其臨床意義

邱麗湞，吳共發(fā)，姚金科，劉鈺君，曾宇婷

（廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院1體檢中心，2病理科，3普外科，廣州，511300）

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，其病理類型以乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）最為多見，占80%～90%[1]。盡管大部分甲狀腺癌預(yù)后較好，但其發(fā)病率呈上升及越來越年輕化趨勢。2014年國家癌癥中心統(tǒng)計報道甲狀腺癌的發(fā)病率已位居我國惡性腫瘤的第7位，占女性惡性腫瘤的第4位[2]，并且部分患者存在明顯侵襲、復發(fā)和轉(zhuǎn)移，影響預(yù)后，因此尋找用于評估其復發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后乃至治療新靶點的生物標志物具有重要臨床意義。細胞周期素依賴性蛋白激酶（cyclin-dependent kinases,CDKs）是細胞周期調(diào)控機制的核心部分，被認為是惡性腫瘤重要的生物學標志物及治療的一個重要靶點，目前新一代CDK4/6抑制物已經(jīng)被美國FDA批準用于進展期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌[3,4]。CDK4和CDK6在甲狀腺癌中的研究甚少，本研究采用免疫組織化學法檢測CDK4和CDK6在PTC的表達及與臨床病理特征的關(guān)系，為探討兩者能否作為甲狀腺癌評估復發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后乃至治療新靶點提供初步理論基礎(chǔ)。

材料與方法

1 資料

收集廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院病理科保存的PTC及其癌旁正常甲狀腺石蠟標本73例，全部病例經(jīng)過病理診斷證實。年齡19～82歲，平均年齡（45.2±14.5）歲，其中男性18例，女55例，男女年齡差異不具有統(tǒng)計學意義。腫瘤最大徑≤2cm的57例，＞2cm的16例；有甲狀腺包膜侵犯的47例，無甲狀腺包膜侵犯的26例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移54例；臨床分期依據(jù)AJCC標準確定[5,6]，其中I+Ⅱ期患者63例，Ⅲ+Ⅵ期患者10例。所有病例術(shù)前均未接受放化療治療。

2 主要試劑

CDK4和CDK6兔單克隆濃縮型抗體購自英國Abcam公司。即用快捷型免疫組織化學MaxVisionTMHRP（Mouse/Rabbit）檢測試劑盒（KIT-5002）、DAB顯色劑、PBS緩沖液、抗體稀釋液和檸檬酸鹽抗原修復液均購自福州邁新公司。

3 免疫組織化學

石蠟組織塊4μm厚切片，70℃烤片30min，常規(guī)脫蠟至水后，按即用快捷型免疫組織化學MaxVisionTMHRP（Mouse/Rabbit）檢測試劑盒說明書操作，切片完全浸泡入檸檬酸鹽修復液，于高壓鍋電磁爐加熱修復3min，自然冷卻后PBS 漂洗5×3min，浸泡在醫(yī)用雙氧水中10min，PBS 漂洗5×3min； 加入一抗（CDK4和CDK6均以1∶200稀釋使用），37℃孵箱1h，PBS 漂洗5×3min，加入二抗，37℃孵箱20min，PBS漂洗5×3min；DAB 顯色，顯微鏡下控色，自來水終止DAB，蘇木素復染細胞核，70℃烤片30min，干片后中性樹脂封固。以PBS取代一抗做陰性對照，按照說明書CDK4以人尿路上皮癌組織為陽性對照，CDK6以人扁桃體組織為陽性對照。

4 結(jié)果判讀

CDK4和CDK6陽性著色定位于細胞核和（或）細胞漿，陽性顯色為細胞中的相應(yīng)部位出現(xiàn)棕黃色顆粒著色。由高年資病理醫(yī)師在光學顯微鏡對切片染色結(jié)果進行判讀，判斷標準如下：按染色強度將無色、淡黃色、棕黃色和棕褐色依次計0、1、2、3分，再將陽性細胞數(shù)所占百分比打分：陰性判為0分，陽性細胞≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分，染色強度與陽性細胞百分比的乘積＞3分判為免疫組化結(jié)果陽性[7]。

5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件，計量資料采用Pearson Chi-Square Test，雙變量相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 CDK4和CDK6在PTC及癌旁正常組織中的表達

CDK4和CDK6在癌旁正常甲狀腺組織絕大部分呈陰性表達，陽性表達率分別為6.8%（5/73）和11.0%（8/73），兩者在PTC組織中表達增高（圖1），陽性表達率分別為58.9%（43/73）和52.1%（38/73），均明顯高于癌旁正常組織中的表達（分別 χ2=44.818，P =0.000；χ2=28.565，P =0.000）。

2 CDK4和CDK6的表達與PTC臨床病理特征的關(guān)系

CDK4和CDK6的陽性表達率與PTC 的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（表1）。CDK4和CDK6在Ⅲ+Ⅳ期病例組織的陽性表達率均為90%，明顯高于I+Ⅱ期的54.0%和46.0%；CDK4和CDK6在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例組織中的陽性表達率均為89.5%，均明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例的48.1%和38.9%。CDK4和CDK6均與患者性別、年齡、腫瘤大小及包膜侵犯無關(guān)（表1）。

3 PTC中CDK4和CDK6表達的相關(guān)性

觀察免疫組織化學染色切片，CDK4陽性表達的PTC組織，同時呈CDK6陽性（圖2）。雙變量相關(guān)性分析顯示CDK4和CDK6具有密切正相關(guān)關(guān)系（Spearman,s相關(guān)系數(shù)r=0.87, P=0.00）。

討 論

圖1 CDK4和CDK6在甲狀腺乳頭狀癌和癌旁組織表達的免疫組織化學檢測。A，CDK4在癌旁正常組織呈陰性表達；B, CDK6在癌旁正常組織呈陰性表達; C, CDK4在甲狀腺乳頭狀癌組織呈陽性表達；D，CDK6在甲狀腺乳頭狀癌組織呈陽性表達，比例尺，50μmFig. 1 Immunohistochemical examination of CDK4 and CDK6 expression in PTC and adjacent tissues. A, the expression of CDK4 in adjacent normal tissue was negative; B, the expression of CDK6 in adjacent normal tissue was negative; C, the expression of CDK4 in PTC was positive; D, the expression of CDK6 in PTC was positive; scale bar, 50μm

表1 CDK4和CDK6的表達與PTC臨床病理特征的關(guān)系Tab. 1 Correlation between the expression levels of CDK4 and CDK6 and the clinicopathological features of PTC

甲狀腺乳頭狀癌總體預(yù)后良好，但少部分低分化、間變性或某些特殊組織類型的乳頭狀癌預(yù)后卻比較差，容易出現(xiàn)復發(fā)、轉(zhuǎn)移及抵抗放射性碘治療[8,9]。我們注意到，惡性腫瘤的失控性增殖和細胞周期往往與CDK活性失調(diào)介導有關(guān)[10]，CDK抑制劑可以抑制Cyclin D-CDK4/6信號通路，因此被作為潛在的治療新靶點[11]。事實上新型的選擇性CDK抑制劑已經(jīng)作為新型靶向藥用于臨床治療某些特定類型的惡性腫瘤[12,13]。但迄今尚未見CDK抑制劑用于臨床上治療甲狀腺癌的報道,且CDK在甲狀腺癌中的相關(guān)研究報道較少。為此，本文通過免疫組織化學法檢測CDK信號通路上與人類腫瘤密切相關(guān)的兩個關(guān)鍵分子CDK4和CDK6，為后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。

圖2 CDK4和CDK6的表達在PTC中具有相關(guān)性。A，CDK4陽性表達的PTC組織；B，A的同一例組織，出現(xiàn)CDK6表達；比例尺，50μmFig. 2 The expressions of CDK4 and CDK6 were positively correlated in PTC. A, CDK4 positive PTC; B, CDK6 was positive in the same tissue; scale bar, 50μm

人類惡性腫瘤是抑癌基因的失活和癌基因的激活所導致的功能效應(yīng)，最終都會體現(xiàn)在細胞周期機制上面。人類的細胞周期分為G1, S, G2和 M期，CDKs對細胞周期的調(diào)控具有重要的作用，目前證實有7個CDK與細胞周期進程直接相關(guān)，分別是CDK1、2、3、4、6、10、11[14]。其中細胞周期蛋白D（cyclin D）能夠激活CDK4和CDK6，活化后的CDK4和CDK6能促進細胞由G1期進入S期，促進有絲分裂[15]，在腫瘤惡性增殖和進展上發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)在甲狀腺未分化癌中，細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制劑的失活對導致CDK表達上調(diào)[16]。Wang等研究顯示CDK4和CDK6的上游基因cyclin D1和cyclin E在侵襲性甲狀腺癌如未分化癌和濾泡變異型的乳頭狀癌中表達增強，與腫瘤發(fā)生和預(yù)后可能有重要作用[17]。國內(nèi)張輝芹等[18]通過基因免疫熒光標記方法檢測了40例PTC的cyclin D1和CDK4表達，結(jié)果顯示PTC組織中cyclin D1和CDK4蛋白相對表達量均明顯高于正常甲狀腺組織，提示兩者在PTC的發(fā)生中可能起到重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，CDK4和CDK6在癌旁正常甲狀腺組織絕大部分呈陰性表達，在PTC 組織表達明顯增高。我們的研究結(jié)果與現(xiàn)有文獻報道有符合趨勢，我們推測PTC的發(fā)生可能與CDK4和CDK6的過度表達有關(guān)。進一步分析發(fā)現(xiàn)高表達CDK4和CDK6的PTC均有更高的臨床分期及出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，兩者具有密切正相關(guān)關(guān)系。更高的臨床分期及出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移往往代表腫瘤更具有侵襲轉(zhuǎn)移能力，推測CDK4和CDK6D在PTC中的異常過度表達與腫瘤惡性進展有關(guān)。而CDK4和CDK6D表達的增強，會促進細胞由G1期進入S期，促進有絲分裂[15]，那么PTC中CDK4和CDK6D的過表達可能促進了細胞惡性分裂增殖，使細胞獲得更強的侵襲轉(zhuǎn)移能力。Cyclin D-CDK4/6-INK4-Rb信號通路的異常存在于大部分惡性腫瘤，阻斷這一通路，會導致G0/G1期阻滯，誘導腫瘤細胞衰老[19,20]。在PTC中阻斷CDK4和CDK6D可能會起到明顯抑制腫瘤生長和誘導腫瘤細胞發(fā)生死亡。因此，針對抑制CDK4和CDK6的選擇性靶向藥可能是治療甲狀腺癌的全新策略。

目前選擇性阻斷CDK4和CDK6的新一代CDK抑制劑如Ribociclib已經(jīng)應(yīng)用于臨床治療某些腫瘤取得安全有效的臨床結(jié)果[12,13]。所以，CDK4和CDK6有望成為PTC治療的新靶點。下一步，我們將以CDK4和CDK6為核心研究點，深入探討cyclin D-CDK4/6-INK4-Rb信號通路在甲狀腺癌中的作用機制以及CDK4/6抑制劑能否作為甲狀腺癌的新治療靶向藥物。