周末組織處理程序的改進(jìn)

王玉環(huán)，方慶全

（廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，廈門 361003）

很多醫(yī)院病理科周末切取的組織采用延時啟動脫水程序進(jìn)行處理[1]。我們通過實踐發(fā)現(xiàn)這樣組織切片易碎、易脫片，即使使用了防脫載玻片，效果也不理想，并且對后續(xù)HE染色、免疫組織化學(xué)檢測、分子病理學(xué)檢測等工作都造成了影響。作者對周末組織處理程序進(jìn)行了改進(jìn)，收到較好的效果。

材料與方法

1 材料

收集廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2017年10月至2017年12月的乳腺癌根治術(shù)標(biāo)本40例，患者年齡24～70歲，平均年齡（41.1±8.7）歲。每例連續(xù)切取3塊組織，取材大小均為 1.5cm×1.5cm，厚0.3cm，隨機(jī)分為日常程序處理組（常規(guī)組）、延時程序處理組（延時組）和改進(jìn)程序處理組（改進(jìn)組）3組。

2 主要設(shè)備與試劑

Leica Peloris脫水機(jī)（德國萊卡）；梯度酒精、二甲苯、石蠟。

3 組織的處理程序

3組組織分別按表1的處理程序進(jìn)行固定、脫水、透明、浸蠟，按常規(guī)進(jìn)行切片、HE染色[2]、免疫組織化學(xué)檢測[3]、熒光原位雜交實驗（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）[4]。

表1 組織處理程序Tab.1 Tissue processing procedure

4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料率的比較采用χ2檢驗，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 改良法不影響切片肉眼可見裂痕或脫片發(fā)生率

切片肉眼可見裂痕或脫片的發(fā)生率在常規(guī)組為 2.50%（1/40），延時組為37.50 %（15/40），改良組為5.00 %（2/40）。常規(guī)組與延時組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=15.31，P＜0.01）；常規(guī)組與改良組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.35，P＞0.05）。

2 改良法不影響HE切片染色質(zhì)量

常規(guī)組切片細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)對比清晰，紅藍(lán)適度；延時組切片紅（細(xì)胞質(zhì)）與藍(lán)（細(xì)胞核）對比稍不清晰，組織結(jié)構(gòu)稍模糊；改良組切片細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)對比清晰，紅藍(lán)適度，染色質(zhì)量與常規(guī)組相近（圖1）。

3 改良法不影響免疫組織化學(xué)檢測質(zhì)量

3組切片免疫組織化學(xué)檢測陽性率相同。但顯色質(zhì)量有所差異，常規(guī)組切片染色強(qiáng)度強(qiáng)、陽性定位準(zhǔn)確、著色均勻、背景清晰、無非特異染色；延時組切片染色強(qiáng)度較弱、陽性定位準(zhǔn)確、著色均勻、背景欠清晰；改良組切片顯色質(zhì)量接近常規(guī)組（圖2）。

4 改良法不影響熒光原位雜交效果

常規(guī)組切片橙色熒光呈蔟狀擴(kuò)增，延時組切片無擴(kuò)增，改良組切片橙色熒光呈點狀擴(kuò)增（圖3）。陽性常規(guī)組和改良組切片熒光原位雜交實驗結(jié)果陽性率均為37.50%（15/40），差異無統(tǒng)計學(xué)意義；延時組陽性率為17.50 %（7/40），與常規(guī)組或改良組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

討 論

活體組織一旦停止血液循環(huán)和物質(zhì)代謝就會因物質(zhì)代謝障礙產(chǎn)生一系列的生物化學(xué)和組織化學(xué)改變，必須盡快進(jìn)行固定，固定的作用是盡量保持細(xì)胞、組織的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)。組織經(jīng)固定后，含有大量水分。組織在透明浸蠟前必須進(jìn)行脫水，就是用某些溶劑將組織內(nèi)的水分逐漸置換出來，以利于透明劑和石蠟的滲入。病理技術(shù)工作者要想制做出優(yōu)良的切片，組織脫水是重要的環(huán)節(jié)。如何設(shè)計出一套適合本科室實用的脫水程序是制片好壞的關(guān)鍵所在。我們科根據(jù)Leica Peloris脫水機(jī)工程師的建議，查閱參考大量文獻(xiàn)，總結(jié)工作經(jīng)驗，設(shè)置了上述常規(guī)組處理程序用于日常組織處理，沿用至今，脫水效果好且穩(wěn)定。遇到周末等節(jié)假日，使用延遲啟動脫水程序時，直接將標(biāo)本長時間固定于10%中性福爾馬林里。這樣的組織處理效果不佳，特別是對后續(xù)的FISH等分子檢測影響尤為明顯。10%中性福爾馬林是由甲醛液：0.01mol/L PBS = 1∶9的比例配制而成。甲醛固定組織的主要作用機(jī)制是在蛋白質(zhì)末端基團(tuán)之間形成交聯(lián)鏈[5]，甲醛與組織蛋白形成橋鍵，時間越長，交聯(lián)越復(fù)雜越緊密，導(dǎo)致后續(xù)免疫組織化學(xué)染色抗原修復(fù)難以修復(fù)完全，組織表達(dá)陽性減弱，甚至出現(xiàn)假陰性。核酸的堿基也涉及到上述過程中，甲醛固定組織會導(dǎo)致基因組 DNA斷裂，甲醛與蛋白質(zhì)的廣泛交聯(lián)阻礙核酸的定量分析并局限了 DNA 片段的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的長度[6-8]。固定時間越長，這種交聯(lián)會越嚴(yán)重，所以長時間的甲醛固定可在一定程度上影響高質(zhì)量 DNA 和（或）RNA 的提取效率[9]。此外甲醛也是分子量最小的含氧有機(jī)物，具有較高的反應(yīng)活性，甲醛介導(dǎo)的DNA損傷在固定3h后就明顯發(fā)生，固定時間越長，甲醛所致的DNA損傷越嚴(yán)重，越不易從中獲得大片段DNA，甲醛固定標(biāo)本的DNA易降解成不同長度的片段，也不利于模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)[10,11]，這些都會影響FISH等分子檢測結(jié)果，導(dǎo)致假陰性。

圖1 HE染色效果比較。A，常規(guī)組；B，延時組；C，改良組；比例尺，100μmFig. 1 Comparison of HE staining results. A, regular group; B, delay group; C, improved group; scale bar, 100μm

綜上所述，遇到雙休日或者國家法定長假休息日，由于工作安排需要，取材的組織將預(yù)約處理。若長時間固定于中性福爾馬林中，組織易脆裂，制片困難，對抗原和基因保存不利。若對程序進(jìn)行優(yōu)化，10%中性福爾馬林的固定時間、二甲苯透明時間、石蠟浸蠟時間與日常處理程序相同，將多余的時間分配給各級梯度乙醇進(jìn)行脫水，這樣不但不會引起組織發(fā)脆、細(xì)胞收縮，反而使組織脫水更徹底，更有利石蠟的滲透，有利于后期制片，特別是有利于后期的HE染色、免疫組織化學(xué)檢測或分子病理學(xué)檢測。

圖2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果比較。A，常規(guī)組；B，延時組；C，改良組；比例尺，50μmFig. 2 Comparison of immunohistochemical staining results. A, regular group; B, delay group; C, improved group; scale bar, 50μm

圖3 熒光原位雜交檢測乳腺癌中基因擴(kuò)增效果比較。A，常規(guī)組；B，延時組；C，改良組；比例尺，10μmFig. 3 Comparison of gene amplification in breast cancer detected by fluorescence in situ hybridization. A, regular group; B, delay group; C, improved group; scale bar, 10μm