ATP酶組織化學(xué)染色孵育方法比較

宋艷，宋美儀，關(guān)偉明

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理學(xué)教研室，廣州 510080)

在肌纖維形態(tài)學(xué)分型研究和肌肉疾病病理診斷上，采用新鮮肌肉標(biāo)本進(jìn)行經(jīng)典ATP酶組織化學(xué)染色非常重要。ATP酶組織化學(xué)主要原理是鈣激活法[1]，當(dāng)新鮮肌肉組織中的三磷酸腺苷酶被三磷酸腺苷水解為二磷酸腺苷和磷酸時(shí)候磷酸與鈣離子結(jié)合，在酶活性處形成無(wú)色的磷酸鈣，磷酸鈣經(jīng)氯化鈷處理，形成磷酸鈷，再經(jīng)硫化銨處理便形成棕黑色的硫化鈷沉淀在酶活性部位。采用新鮮肌肉組織做相關(guān)病理學(xué)檢查，因?yàn)榻M織本身時(shí)效要求嚴(yán)格，但是在肌肉各種特殊染色實(shí)驗(yàn)操作中的步驟繁復(fù)且需時(shí)較長(zhǎng)，所以實(shí)驗(yàn)者們一直在臨床運(yùn)用中不斷的改進(jìn)和完善。如何在簡(jiǎn)化或者改進(jìn)步驟的同時(shí)，保證染色結(jié)果的穩(wěn)定有效性是基本條件。現(xiàn)收集我院2017年送到我科做肌肉活檢的病例，比對(duì)不同孵育方法下染色結(jié)果總結(jié)各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

材料和方法

1 取材與冷凍切片

由本院臨床科室取新鮮肌肉組織，注意取其橫斷面，直徑約5～7mm，不加任何固定液，用生理鹽水浸過的紗布包好，切忌不能在室溫下過夜，送檢病理科。把盛有異戊烷的50ml離心管置于液氮中，見有白色凝結(jié)物時(shí)鑷子夾住肌肉組織放入冷凍約30s。然后裝入凍存管中置液氮中保存或馬上放進(jìn)-25℃冷凍切片機(jī)切片。切片厚度為6～8μm。

2 主要試劑的配制

Tris-鈣緩沖液：Tris（Hydroxymethyl）methylamine 3.025g；氯化鈣0.499g；去離子水加至250ml；現(xiàn)配現(xiàn)用。酸性前孵育液：（pH4.35）乙酸鈉0.2mol/L 9ml，乙酸0.2mol/ L 21ml，調(diào)pH至4.35，堿性前孵育液：Tris-鈣緩沖液30ml，以0.1mol/L HCl仔細(xì)調(diào)至pH 10.4；ATP酶孵育液：a滴染法，ATP（disodium salt）45mg；Tris-鈣緩沖液30mL；b浸染法，ATP（disodium salt）90 mg；Tris-鈣緩沖液 60ml，0.1mol/L HCl調(diào)至 pH 9.5。ATP（disodium salt），異戊烷（isopentane）購(gòu)自Sigma，其他化學(xué)試劑均為其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

3 ATP酶染色方法

ATP酶染色采Padykula和Herman法，37℃（pH9.4）孵育30min，硫化鈷黑色沉淀為陽(yáng)性反應(yīng)，I型纖維呈淺染反應(yīng)，Ⅱ型纖維呈深染反應(yīng)[2]。已切好冰凍切片不用固定，在室溫（25℃左右）下干燥30min，滴染法的玻片用免疫組化筆在玻片組織周圍畫圈（前孵育結(jié)束后），浸染法不用。分組：滴染法分為37℃孵育120～180min和4℃冰箱過夜。浸染法也分為37℃孵育120～180min和4℃冰箱過夜。將已干燥的玻片分別放入酸、堿性前孵育液30mL浸染缸，室溫（25℃）下孵育30～60min，過雙蒸水兩遍。a滴染法：滴入ATP酶孵育液適量（多少由組織本身大小決定），37℃孵育120～180min和4℃冰箱孵育過夜；b浸染法：浸入ATP染色缸（提前37℃恒溫箱預(yù)熱）120～180min和4℃冰箱孵育過夜。1%氯化鈣作用兩次，第一次快速漂洗一遍，第二次作用3min。置2%硝酸鈷反應(yīng)3min。自來(lái)水快洗，再用去離子水洗2次。1%多硫化銨顯色（現(xiàn)配現(xiàn)用），酸性前孵育液處理的切片反應(yīng)約5min，堿性前孵育液處理的切片反應(yīng)約3min。自來(lái)水充分沖洗，過去離子水，常規(guī)脫水封片。

結(jié) 果

因?yàn)榍胺跤簆H的不同，ATP酶染經(jīng)過多硫化銨顯色之后，根據(jù)顏色深淺不一可分為不同的纖維類型。I型因肌纖維收縮較慢而活動(dòng)持久，其ATP酶活性高，染色深；Ⅱ型是收縮快，但是活動(dòng)不持久，其ATP酶活性低，染色淡。各種ATP酶染色解果均可明顯看見正常骨骼肌纖維分為I型和Ⅱ型，兩種類型肌纖維交織排列，且橫切面多呈橢圓形大小均勻，形狀規(guī)則，縱切面看見肌肉纖維條狀分布。比較不同染色方法和孵育條件的染色效果顯示：4℃過夜滴染的染色效果較恒溫箱37℃滴染的效果好；37℃浸染的效果比4℃過夜浸染的效果好，雖然浸染過夜容易產(chǎn)生沉淀，但是過濾ATP酶孵育液后再使用，染色效果仍然好 (圖 1)。

討 論

組織化學(xué)染色是利用組織細(xì)胞內(nèi)酶具有催化某種反應(yīng)的特性來(lái)檢測(cè)酶活性。在一定的條件下全酶進(jìn)行催化作用，產(chǎn)生一種可見產(chǎn)物，沉淀在酶所在的部位，最終通過顯微鏡對(duì)酶的活性進(jìn)行定位或定量研究[3]。經(jīng)典的ATP酶的染色更是在臨床肌肉組織疾病的診斷起著非常重要的作用。根據(jù)組織化學(xué)、超徽結(jié)構(gòu)、生化和生理特點(diǎn)可把肌肉纖維分類為I型、Ⅱ型(包括ⅡA、ⅡB)。I型與Ⅱ型相比，I型的ATP酶活性低，收縮啟動(dòng)慢，氧化能力高，糖酵解能力低，比Ⅱ型更耐疲勞。Ⅱ型纖維又可以分為ⅡA、ⅡB兩個(gè)亞型，兩者相比，ⅡA型的ATP酶活性高，收縮啟動(dòng)快，氧化能力高，糖酵解能力高，比ⅡB更耐疲勞。ⅡB型的ATP酶活性高，收縮啟動(dòng)快，氧化能力低，糖酵解能力高，比ⅡA更耐疲勞[4]。在肌肉疾病發(fā)生、發(fā)展過程中肌纖維形態(tài)和類型均隨之變化，如I型肌纖維變化比較明顯的情況常見于肌強(qiáng)直性肌萎縮、線狀體肌病等；II型纖維改變常見于重癥肌無(wú)力、急性去神經(jīng)支配的肌肉組織等。有些疾病如肢帶型肌營(yíng)養(yǎng)不良可見兩型纖維均肥大。相反萎縮型病變也可選擇性地累及某一型纖維[5]。

在普通HE染色觀察的基礎(chǔ)上，取新鮮肌肉組織進(jìn)行病理組織檢查是根據(jù)肌肉酶活性的特點(diǎn)采用經(jīng)典的ATP酶特殊染色方法，此法在臨床神經(jīng)肌肉病變?cè)\斷中具有重要的作用。而新鮮肌肉標(biāo)本的ATP酶染色過程復(fù)雜，步驟多并且耗時(shí)長(zhǎng)。但是在骨骼肌臨床病理診斷中以及相關(guān)的醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究中采用此方法，可以清楚地觀察到兩種肌纖維的形態(tài)、分布和比例的變化[6]，因此，秉承經(jīng)典方法的同時(shí)并不斷改進(jìn)和總結(jié)具有重要意義。ATP酶組織化學(xué)技術(shù)已沿用多年，在經(jīng)典方法的基礎(chǔ)上有過實(shí)驗(yàn)者的改進(jìn)和不斷的完善[7]，總結(jié)各種改良之后方法發(fā)現(xiàn)效果還是有不同程度的差異。滴染法沿用我科張萌老師的方法[6]，在送檢標(biāo)本極少的時(shí)候且在不影響診斷的前提下可以節(jié)約一定成本。在標(biāo)本量比較多時(shí)，玻片數(shù)量多時(shí)采用浸染的方法更能取得好的染色效果。采用4℃孵育，適合肌肉病變過程中有能量反應(yīng)減弱時(shí)候，雖然結(jié)合緩慢，但結(jié)合效果比較好，非特異染色也比較少?？偨Y(jié)此次實(shí)驗(yàn)：改變孵育條件，滴染4℃過夜的染色深度比恒溫箱37℃的效果好；改變孵育方法，浸染的37℃比浸染4℃過夜效果好，浸染過夜容易有沉淀，但是過濾之后染色效果仍然滿意。

圖1 不同染色方法與孵育條件ATP酶活性染色效果比較。A和B，4℃滴染；C和D，37℃滴染；E和F，4℃浸染；G和H， 37℃浸染；A、C、E和G，前孵育液pH4.35；B、D、F和H，前孵育液pH10.4 ；比例尺，20μmFig. 1 Comparison of the staining effects of ATPase activity using different methods. A and B, dropping stain at 4°C; C and D, dropping stain at 37°C;E and F, dipping stain at 4°C; G and H, dipping stain at 37°C; A, C, E and G, pH4.35; B, D, F and H, pH10.4; scale bar, 20μm

應(yīng)用這些方法染色時(shí)，應(yīng)注意以下事項(xiàng)：①冰凍切片前應(yīng)注意保存在液氮罐的肌肉標(biāo)本必須提前拿出放入-25℃左右解凍，時(shí)間至少8h或者過夜。②需嚴(yán)格并精確調(diào)試所用試劑的pH值，標(biāo)準(zhǔn)液必須保證新鮮且準(zhǔn)確，標(biāo)準(zhǔn)曲線的誤差應(yīng)控制在0.1之內(nèi)。③將肌組織切片事先在不同pH的液體內(nèi)進(jìn)行前孵育，可以抑制某一型肌纖維的ATP酶活性。如堿性環(huán)境中抑制I肌纖維ATP酶活性，因此經(jīng)堿性孵育液孵育，Ⅱ型纖維著色深，I型纖維無(wú)色。而酸性環(huán)境抑制Ⅱ型肌纖維的ATP酶活性，經(jīng)酸性孵育液孵育后，I型纖維著色最深，Ⅱ型纖維無(wú)色，要求孵育液的pH值一定要測(cè)量準(zhǔn)確，可允許的誤差范圍0.1。堿性前孵育液保存期間pH易發(fā)生改變，染色效果變差，一般應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。酸堿前孵育結(jié)束可以過水，但切忌過自來(lái)水沖洗，因?yàn)樽詠?lái)水中化學(xué)離子會(huì)影響已經(jīng)調(diào)試好pH反應(yīng)環(huán)境。④過濾：ATP酶孵育液完全溶解之后，在加入條件為4℃冰箱過夜需要過濾，否則很容易形成沉淀，導(dǎo)致背景沉積雜質(zhì)。⑤ATP酶的染色結(jié)束后進(jìn)行常規(guī)脫水透明封片，不宜在二甲苯中浸泡太久，否則容易脫色。

在臨床操作中經(jīng)典的染色方法在客觀條件影響下，結(jié)果差異時(shí)常有，但是為了達(dá)到很好的顯色效果，根據(jù)實(shí)際條件選擇合適的孵育方法，提高染色跟診斷的時(shí)效性，更有助于臨床工作進(jìn)展。