東北虎胎盤PLAC-8基因的分離與結(jié)構(gòu)分析

李 倩 元虹懿 杜海榮 張明海

(東北林業(yè)大學野生動物資源學院，哈爾濱，150040)

胎盤特異蛋白8(placenta-specific8，PLAC-8)是一種富含半胱氨酸的蛋白。廣泛分布于真核生物中。PLAC-8最初是在懷孕8.5～12.5 d的小鼠胎盤中發(fā)現(xiàn)的，其在胎盤中的表達是在胎兒中的10倍，主要在胎兒植入子宮之前的滋養(yǎng)外胚層細胞和滋養(yǎng)層巨噬細胞以及隨后發(fā)育的成膠質(zhì)層細胞中表達，起到連接胎兒和母體的作用[1-2]。在成年個體中，PLAC-8基因在人的漿細胞樣樹突狀細胞和免疫系統(tǒng)中的淋巴結(jié)、脾和骨髓中高度表達，在外周血白細胞、闌尾和胎兒肝臟和胸腺中低表達，在心臟和大腦中不表達[3-4]。其功能也得到越來越廣泛的研究。發(fā)現(xiàn)其不僅可以調(diào)控細胞的分裂、分化和凋亡，還在機體免疫過程中發(fā)揮重要作用。國外多項研究結(jié)果表明，PLAC-8可能是胚胎著床過程中的關鍵分子，可作為生物標志分子之一預測動物的妊娠結(jié)局。

1 材料與方法

1.1 材料

東北虎(Pantheratigrisaltaica)胎盤cDNA文庫為本實驗室構(gòu)建，滴度為2.79×106pfu/mL。

1.2 方法

利用通用引物對胎盤組織原始文庫中大量隨機挑取單菌落進行雙向測序，采用Cross-match軟件去除EST中低質(zhì)量序列、載體序列、重復序列等，利用Seqman軟件對高質(zhì)量的ESTs序列進行聚類和拼接，得到重疊群和單拷貝EST。對拼接后的序列采用BLASTX和BLASTN程序(https：∥blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)，在NCBI Genbank核酸庫中進行序列同源性比對，利用同源克隆的方法，根據(jù)PLAC-8基因的全長設計引物PLAC-8-F(5′-GCCCTTCGGAACTTAGCCTT-3′)和PLAC-8-R(5′-AGCAGGTGCAGTGTGTCATT-3′)進行PCR擴增，反應條件為94℃ 5 min；94℃ 30 s，50℃ 40 s，72℃ 45 s，35個循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的凝膠電泳檢測，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DN5a，挑去陽性菌落進行培養(yǎng)，搖菌制備質(zhì)粒，并對菌落質(zhì)粒DNA進行雙向測序。

1.3 序列分析

采用ORF finder(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找序列的開放閱讀框，使用NCBI的Blastx程序進行氨基酸同源性比較。軟件SignalP3.0預測蛋白的信號肽，TMpred軟件預測此蛋白的跨膜區(qū)。ExPASy ProtParam對氨基酸蛋白質(zhì)相對分子量、理論等電點以及蛋白質(zhì)的親疏水性等性質(zhì)進行了分析；PSORT II和SOPMA軟件進行蛋白的亞細胞定位及二級結(jié)構(gòu)預測；根據(jù)SWISS-MODEL軟件準確預測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)；利用軟件MEGA 7.0進化樹的繪制，對蛋白的親緣關系進行分析。

2 結(jié)果

2.1 PLAC-8基因全長cDNA的獲得

對東北虎胎盤組織cDNA文庫中得到的PLAC-8基因的陽性菌落進行PCR鑒定，得到一條長度在300 bp左右的DNA插入片段(圖1A)，進一步對該陽性克隆進行質(zhì)粒提取及雙向測序，測序結(jié)果為648 bp，與預測片段大小一致(圖1B)。其中CDS區(qū)域長度為330 bp，共編碼了109個氨基酸的蛋白。經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫進行Blast比對分析，證實為PLAC-8基因的全長序列(圖1C)。

圖1 A.東北虎胎盤PLAC-8基因cDNA菌落PCR結(jié)果；B.東北虎胎盤PLAC-8基因克隆PCR結(jié)果；C.PLAC-8基因的cDNA及推定的氨基酸序列。起始密碼子(ATG)，終止密碼子(TAA)，終止由星號(*)表示Fig.1 A.The PCR results of PLAC-8 gene in placenta cDNA colony；B.The cloning PCR results of PLAC-8 gene；C.The cDNA sequence and deducedamino acid sequence of the PLAC-8 gene.The initiation codon(ATG)，the termination codon(TAA)，stop code is marked with an asterisk(*)

2.2 PLAC-8基因序列分析

對獲得的序列應用NCBI的ORF程序進行開放讀碼框的查找，結(jié)果顯示，5′非翻譯區(qū)為93 bp，3′非翻譯區(qū)為225 bp，開放讀碼框為330 bp，編碼109個氨基酸；使用ProtParam程序預測該蛋白的相對分子質(zhì)量為11981.98，理論等電點(Theoretical pI)為6.01，整個氨基酸組成中半胱氨酸(Cys)占最大比例(11.9%)、甘氨酸(Gly)(10.1%)和亮氨酸(Leu)(9.2%)；Expasy Protscale 程序分析PLAC-8蛋白親水性/疏水性的結(jié)果如圖2所示，PLAC-8蛋白氨基酸殘基中以P507疏水性最強(1.833)，以P134親水性最強(-0.467)，疏水氨基酸的數(shù)量大于親水氨基酸，故推斷PLAC-8為疏水性蛋白。

SignalP 4.1軟件預測其一級結(jié)構(gòu)N-端氨基酸不具有信號肽特征；利用在線工具TMHMM 2.0 對PLAC-8氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)域進行預測，PLAC-8蛋白N端在細胞膜內(nèi)的可能性為0.10438，預測PLAC-8蛋白不具有跨膜區(qū)。使用PSORTⅡ軟件進行亞細胞定位分析表明，該蛋白主要存在于細胞質(zhì)(39.1%)、細胞核和線粒體(26.1%)；SOPMA 軟件預測結(jié)果顯示，PLAC-8二級結(jié)構(gòu)元件主要以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主(分別占41.28%，34.86 %)，其次是延伸結(jié)構(gòu)(13.76%)，最少的為β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)(10.09%)(圖3A)。

采用 SWISS-MODE建模方式對PLAC-8蛋白進行三維空間模型(圖3B)。推導PLAC-8 蛋白模型分值為 0.38，蛋白序列的相似性為 36.36%。

圖2 PLAC-8蛋白的親水性、疏水性Fig.2 Prediction on hydrophobicity/hydrophilicity of PLAC-8

圖3 A.PLAC-8 的二級結(jié)構(gòu)預測；B.PLAC-8 的三維結(jié)構(gòu)預測Fig.3 A.Prediction on secondary structure of PLAC-8；B.Prediction on tertiary structure of PLAC-8

2.3 不同物種間PLAC-8的同源性分析

從GenBank中選取部分動物，將東北虎PLAC-8氨基酸全序列進行BlastX，發(fā)現(xiàn)與家貓(Feliscatus)、美洲豹(PantheraPardus)、大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)、狼(Canislupus)、白犀(Ceratotheriumsimumsimum)等哺乳動物PLAC-8具有較高同源性(80%～99%)，其中與家貓、美洲豹和獵豹(Acinonyxjubatus)的同源性最高(99%)；而與馬來穿山甲(Manisjavanica)、埃及果蝠(Rousettusleschenaultii)和野豬(Susscrofa)的PLAC-8氨基酸序列之間的變異程度較大，同源性較低，分別為80 %。經(jīng)Mega 7.0 ClustalX聚類分析后，采用Neighbor-Joining法，在進行1000次bootstrap統(tǒng)計學檢測的基礎上構(gòu)建進化樹(圖4)。結(jié)構(gòu)表明，東北虎與家貓和獵豹的PLAC-8蛋白處于同一進化分支，說明在遺傳進化中東北虎與家貓和獵豹的親緣關系較近。由系統(tǒng)發(fā)育樹圖知，PLAC-8基因進化關系復雜多樣，不同物種的PLAC-8基因多為不同的類群。

圖4 東北虎PLAC-8蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of PLAC-8 protein

3 討論

胎盤特異性抗原8，又稱作C15，首次在人(Homosapiens)樹突狀細胞[5]發(fā)現(xiàn)。在小鼠(Musmuscalus)中PLAC-8蛋白由112個氨基酸(amino acid，aa)組成，人和黑猩猩(Pantroglodytes)的PLAC-8蛋白都是由115個氨基酸(aa)組成，并且序列完全一致，東北虎的PLAC-8蛋白編碼109個氨基酸，可見哺乳類的PLAC-8具有相似的特性。PLAC-8蛋白的分子結(jié)構(gòu)目前并不清楚，就該分子的一級結(jié)構(gòu)而言，第30～110個氨基酸之間有很保守的半胱氨酸(Cys)富集區(qū)，并且此半胱氨酸富集區(qū)在脊椎動物中很保守[6]。多數(shù)半胱氨酸形成一個CXXC結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含3～4個分子內(nèi)二硫鍵，是該分子底物的特異性結(jié)合位點。PLAC-8分子的N端沒有明顯的信號肽結(jié)構(gòu)，所以該分子是否可以分泌到細胞外，目前尚無一致報道。高等動物的PLAC-8基因有很高的同源性，但在兩棲和低等動物的相似性很低。這表明，PLAC-8在進化早期階段是不穩(wěn)定的，到爬行動物的結(jié)構(gòu)開始穩(wěn)定并不再改變時表明PLAC-8的功能比之前更加穩(wěn)定和重要[7]。

PLAC-8廣泛分布于真核生物中[8-9]進化上相對保守。PLAC-8蛋白在卵母細胞和不同發(fā)育階段的早期植入前胚胎均有表達，主要分布在細胞質(zhì)。近期在人的胎盤研究中發(fā)現(xiàn)PLAC-8定位于絨毛外滋養(yǎng)層細胞(extravillous trophoblast，EVT)，可促進滋養(yǎng)層細胞的浸潤遷移。最近我國科學家進行了一項人類圍種植期胚胎單細胞核糖核酸(ribose nucleic acid，RNA)測序的研究[10]，從中數(shù)據(jù)挖掘顯示PLAC-8從卵母細胞到桑椹胚期表達都很低，在囊胚期表達開始升高，同時滋養(yǎng)外胚層與內(nèi)胚層、外胚層之間表達有顯著差異，壁層滋養(yǎng)外胚層與極滋養(yǎng)外胚層表達也有一定差異，但單細胞之間表達差別較大。有關PLAC-8的生殖生物學功能研究尚處于起步階段，PLAC-8在早期胚胎的表達、定位及胚胎早期植入過程中是否表達目前尚無人報道。