恩替卡韋、干擾素治療HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者肝組織內(nèi)HBV cccDNA變化差異及相關(guān)性分析

莊立偉，趙瑩瑩，全 敏，李 玥，李 賁，王笑梅，歐蔚妮，邢卉春

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院肝三科，北京 100015

全球約2.4億人HBV慢性感染[1-2]，感染慢性化，是由于被感染肝細(xì)胞核內(nèi)HBV cccDNA的持續(xù)存在[3-7]。HBV感染經(jīng)臨床治愈后，仍然有低水平的cccDNA存在，HBsAg陰轉(zhuǎn)后，仍可以發(fā)生病毒復(fù)發(fā)[8-9]。cccDNA在肝細(xì)胞核中數(shù)量比較穩(wěn)定，稱為cccDNA池[10-11]。cccDNA池的存在可能發(fā)揮以下作用：(1)持續(xù)作為病毒復(fù)制模板；(2)cccDNA的非半保留復(fù)制機(jī)制，使抗病毒治療效果受到影響；(3)停止抗病毒治療后易復(fù)發(fā)，病情反復(fù)。抑制或根除cccDNA可以獲得顯著的臨床效果，如病情進(jìn)展得到控制、HCC發(fā)病率降低[12-14]，血清學(xué)陰轉(zhuǎn)后HCC相關(guān)肝臟部分切除術(shù)或肝移植術(shù)后HBV復(fù)發(fā)率降低[15-17]。因此，我們通過定量檢測HBV cccDNA及相關(guān)指標(biāo)的變化，分析恩替卡韋、干擾素對肝組織內(nèi)HBV cccDNA含量及HBV復(fù)制能力的影響，同時(shí)分析HBV cccDNA變化與血清生化學(xué)、病毒學(xué)指標(biāo)之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1病例選擇從慢性乙型肝炎抗病毒治療研究中選擇HBeAg陽性且治療前后均行肝穿刺活檢檢查的病例40例。其中接受恩替卡韋治療者24例：口服恩替卡韋0.5 g，1次/d，共24周；接受干擾素治療者16例：α2b-干擾素500萬單位肌注，隔日1次，共24周。

1.2數(shù)據(jù)及標(biāo)本收集收集所有病例人口統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)、生化學(xué)指標(biāo)、病毒學(xué)指標(biāo)，以及治療前后肝穿組織蠟塊。

1.3HBVcccDNA定量檢測肝組織DNA用QIAgen公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒提取。HBV cccDNA采用實(shí)時(shí)定量PCR方法[18]，實(shí)現(xiàn)HBV cccDNA的特異性擴(kuò)增。

2 結(jié)果

2.1患者人口統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析恩替卡韋組和干擾素組性別、年齡、病程、體質(zhì)量相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性(見表1)。

表1 人口統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析 Tab 1 Analysis of demographic data

2.2兩治療組肝組織內(nèi)HBVcccDNA、總HBVDNA及血清總HBVDNA含量兩治療組肝組織內(nèi)HBV cccDNA基線值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.050)；治療后兩組HBV cccDNA值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)，恩替卡韋組明顯優(yōu)于干擾素組。兩治療組肝組織內(nèi)HBV DNA(log10拷貝/ml)基線值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.134)，治療后兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)，恩替卡韋組明顯優(yōu)于干擾素組。血清總HBV DNA(log10拷貝/ml)基線值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.929)，治療后兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)，恩替卡韋組明顯優(yōu)于干擾素組。兩組肝組織內(nèi)HBV cccDNA、肝組織總HBV DNA、血清總HBV DNA治療前后比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)(見表2)。

表2 肝組織內(nèi)HBV cccDNA、總HBV DNA及血清總HBV DNA含量 Tab 2 The content of HBV cccDNA in liver tissues, total HBV DNA and HBV DNA in serum log10 copies/ml

2.3肝組織內(nèi)HBVcccDNA下降百分率與治療后HBeAg之間的相關(guān)性分析DNA下降百分率(%)=(基線DNA值-治療后DNA值)/基線DNA值×100%。對肝組織內(nèi)HBV cccDNA下降百分率與治療前后ALT、AST、TBIL、DBIL、TP、HBsAg、HBeAg進(jìn)行相關(guān)性分析顯示，肝組織內(nèi)HBV cccDNA下降百分率與治療后HBeAg有顯著相關(guān)性(R2=0.183，P<0.05)(見圖1)。

圖1 肝組織內(nèi)HBV cccDNA下降百分率與治療后HBeAg的相關(guān)性分析Fig 1 Correlation analysis between the decreased ratio of HBV cccDNA in liver tissues and post-treatment HBeAg

2.4HBV復(fù)制指數(shù)分析HBV復(fù)制指數(shù)=血清總HBV DNA(log10拷貝/ml)/肝組織內(nèi)HBV cccDNA(log10拷貝/ml)。兩治療組基線HBV復(fù)制指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.171)，兩組治療后較治療前均有所下降，恩替卡韋組優(yōu)于干擾素組，但兩組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.210)(見表3。)。

表3 HBV復(fù)制指數(shù)分析Tab 3 Analysis of the replication index of HBV

3 討論

一般認(rèn)為，慢性乙肝患者在HBsAg血清轉(zhuǎn)換、血清HBV DNA陰轉(zhuǎn)、肝功恢復(fù)正常之后，即表明患者在生化學(xué)及組織學(xué)意義上的肝臟炎癥就已消除。但WERLE-LAPOSTOLLE等[19]定量檢測22例阿德福韋酯治療的慢性乙肝患者肝組織HBV cccDNA，發(fā)現(xiàn)治療48周后，發(fā)生HBsAg清除及HBeAg陰轉(zhuǎn)的患者肝組織仍檢測到HBV cccDNA。SUNG等[20]隨訪觀察了47例拉米夫定單一或聯(lián)合聚乙二醇干擾素治療1年的HBeAg陽性慢性乙肝患者，在治療結(jié)束時(shí)及結(jié)束后52周測定血清HBV DNA及肝組織HBV cccDNA，29例在治療結(jié)束時(shí)有病毒學(xué)應(yīng)答，其中15例在治療結(jié)束后52周仍有持續(xù)應(yīng)答反應(yīng)，但患者肝組織中均存在HBV cccDNA。提示此類患者肝臟中仍然存在低水平的乙肝病毒復(fù)制，在化療或免疫抑制劑使用的情況下，乙肝病毒可能重新復(fù)制活躍。因此，減少肝細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA的含量或抑制病毒復(fù)制能力，是治愈HBV慢性感染的關(guān)鍵。

本研究數(shù)據(jù)顯示，HBeAg陽性的慢性乙型肝炎患者治療后肝細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA在恩替卡韋組與干擾素組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，恩替卡韋組明顯優(yōu)于干擾素組。血清總HBV DNA、肝組織內(nèi)總HBV DNA數(shù)據(jù)分析結(jié)果也如此。提示恩替卡韋、干擾素均能有效降低肝組織內(nèi)HBV cccDNA、血清總HBV DNA含量、肝組織總HBV DNA，恩替卡韋優(yōu)于干擾素。

對肝內(nèi)cccDNA下降百分率與治療前后病毒學(xué)、生化學(xué)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)肝組織內(nèi)HBV cccDNA下降百分率與治療后HBeAg有顯著相關(guān)性(R2=0.183)，治療后HBeAg越少，HBV cccDNA下降幅度越大。這提示，對于HBeAg仍陽性的患者，可以通過監(jiān)測HBeAg變化，了解肝組織內(nèi)HBV cccDNA含量，了解抗病毒治療的應(yīng)答情況。

HBV復(fù)制指數(shù)反映HBV以cccDNA為模板復(fù)制為各種病毒DNA的活動程度。HBV cccDNA活性可能受到表觀遺傳調(diào)控的影響，包括DNA甲基化、組蛋白乙酰化等[21-23]。DNA復(fù)制指數(shù)能夠反映病毒的復(fù)制能力，HBeAg陽性患者數(shù)值較高，提示病毒復(fù)制活躍。不同的免疫狀態(tài)，也會影響復(fù)制指數(shù)[24-25]。非活動性HBeAg陽性慢性乙肝患者cccDNA水平及病毒復(fù)制指數(shù)低于活動性HBeAg陽性慢乙肝患者[26-27]。本研究顯示，治療前恩替卡韋組HBV復(fù)制指數(shù)組內(nèi)對比，恩替卡韋組治療后顯著低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，干擾素組治療前后相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說明恩替卡韋可以有效抑制病毒復(fù)制，而α-干擾素則未觀察到。這與GUO等[21]發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞分裂期，α-干擾素不能有效加快HBV cccDNA丟失一致。兩治療組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與樣本量小有關(guān)。分析結(jié)果提示，恩替卡韋直接抑制病毒復(fù)制，而干擾素直接抑制病毒能力弱，可能其主要通過免疫調(diào)節(jié)來清除病毒。

研究表明，HBeAg陽性的慢性乙型肝炎患者，恩替卡韋和干擾素治療均能降低肝組織內(nèi)HBV cccDNA含量，恩替卡韋治療效果更好。對HBV復(fù)制指數(shù)的影響，兩者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肝內(nèi)HBV cccDNA下降百分率與治療后HBeAg有顯著相關(guān)性，提示臨床上對于HBeAg陽性的患者可以通過監(jiān)測其含量了解肝內(nèi)cccDNA的變化。