羅非魚(yú)皮膠原蛋白肽制備的工藝優(yōu)化

李敏雄，郭斌，劉飛，曹庸

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省天然活性物工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510642）（2.廣州綠萃生物科技有限公司，廣東廣州 510665）

目前膠原蛋白及活性肽被廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)療、食品、化妝品、飼料、皮革和影像等諸多領(lǐng)域[1]。膠原蛋白肽因其弱的抗原性、低過(guò)敏性、易水解、原料廉價(jià)易得和良好的生物相容性，受到眾多行業(yè)的青睞[2]。水產(chǎn)膠原蛋白活性肽具有保護(hù)胃粘膜、抗?jié)儭⒖寡趸?、抗過(guò)敏、抗腫瘤、抗衰老、降血壓、降膽固醇、增強(qiáng)骨強(qiáng)度、預(yù)防骨質(zhì)疏松、預(yù)防關(guān)節(jié)炎、促進(jìn)傷口愈合、促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞的修復(fù)和生長(zhǎng)、促進(jìn)皮膚膠原代謝、免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能[3]。相對(duì)分子質(zhì)量低的小肽易被腸道吸收，且在體內(nèi)生理功能不易被破壞[4]。

羅非魚(yú)是我國(guó)養(yǎng)殖量居于第二位的魚(yú)種[5]。2016年產(chǎn)量為186.64萬(wàn)噸[6]。目前，羅非魚(yú)的生產(chǎn)加工主要以出口冷凍魚(yú)肉片為主，加工過(guò)程產(chǎn)生的下腳料占全魚(yú)重的60%~70%，包括魚(yú)皮、魚(yú)頭、魚(yú)鰭和魚(yú)骨[7]。這些副產(chǎn)物中含有豐富的蛋白質(zhì)，其中魚(yú)皮中含有的膠原蛋白最為豐富[8]，但魚(yú)皮副產(chǎn)物大部分作為飼料魚(yú)粉的原料或廢料丟棄，既污染了環(huán)境，又造成了經(jīng)濟(jì)上的損失[9]。對(duì)這些魚(yú)皮進(jìn)行有效利用，避免浪費(fèi)的同時(shí)還可減少環(huán)境污染[10]。長(zhǎng)期以來(lái)，膠原主要來(lái)源于豬、牛等陸生動(dòng)物，但是隨著瘋牛病、口蹄疫的頻發(fā)以及宗教和文化的差別，豬、牛來(lái)源膠原的應(yīng)用受到了限制[11]。在這種背景下，水產(chǎn)膠原的研究和應(yīng)用逐漸受到科研工作者的重視。由于羅非魚(yú)皮的豐富來(lái)源及安全性因素，使得近年來(lái)羅非魚(yú)皮成為了新的膠原蛋白肽來(lái)源，從羅非魚(yú)皮中提取膠原蛋白肽已經(jīng)成為了當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[12]。因此如何將這些加工過(guò)程中產(chǎn)生的魚(yú)皮廢棄物變廢為寶成為了研究的關(guān)鍵[13]。雖然目前已有大量羅非魚(yú)皮制備膠原蛋白肽的報(bào)道，但是還存在工藝研究不夠系統(tǒng)嚴(yán)謹(jǐn)、方法指標(biāo)選擇不夠科學(xué)、魚(yú)皮脫脂效果差導(dǎo)致其膠原蛋白肽品質(zhì)差等問(wèn)題。為了解決這些問(wèn)題，本課題在前人的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)在這些方面進(jìn)行研究工作。

由于酶水解法相比于熱水抽提法、酸水解法、堿水解法條件溫和，能在一定條件下進(jìn)行定位水解分裂產(chǎn)生特定的肽，且氨基酸不會(huì)被破壞，構(gòu)型也不發(fā)生變化，所以近年來(lái)多被采用于魚(yú)皮的降解中[14]。本課題旨在利用沿海地區(qū)淡水養(yǎng)殖的羅非魚(yú)加工下腳料-魚(yú)皮為原料，以水解度、水解產(chǎn)物分子量和感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)，以堿性蛋白酶水解法，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)確定富含低分子量的羅非魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白肽制備的新型制備工藝。為生產(chǎn)魚(yú)皮膠原肽產(chǎn)品提出了新的思路，為工業(yè)化提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚(yú)皮，廣東省明基水產(chǎn)品有限公司；堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、和胰蛋白酶，廣西南寧龐博生物工程有限公司；胃蛋白酶，廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；鄰苯二甲醛(OPA)，上海麥克林生化科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

低溫連續(xù)相變萃取裝置，自制；DELTA320型pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；電熱恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器，常州國(guó)華電器有限公司；UV-1750型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，島津（中國(guó)）有限公司；LC-10A型高效液相色譜儀（配有紫外檢測(cè)器），日本島津公司；TSKgel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm凝膠柱，東曹（上海）生物科技有限公司；L530臺(tái)式低速離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酶解工藝

稱取一定量脫脂的干制羅非魚(yú)皮，常溫按照1:20添加三級(jí)水浸泡2 h，用蒸餾水洗樣品并過(guò)濾，重復(fù)3次。置于三角瓶中，按料液比1:15加入三級(jí)水，料液在酶解前經(jīng)熱處理，即在85 ℃條件下，熱處理20 min。冷卻至室溫后，分別在各酶的最適溫度下預(yù)熱10 min后，用5 mol/L HCl溶液或5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至各酶的最適pH。然后加入一定量的蛋白酶啟動(dòng)水解反應(yīng)，置于酶的最適溫度下恒溫酶解。待酶解反應(yīng)進(jìn)行一定時(shí)間后，立即將水解混合物從恒溫?fù)u床內(nèi)取出，將水解液的溫度升高至95 ℃并持續(xù)加熱20 min以使酶失活。冷卻至室溫，然后4500 r/min離心15 min，收集上清液，用水定容。

1.3.2 酶解單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 加酶量對(duì)酶解反應(yīng)的影響

固定料液比1:15、溫度50 ℃、pH 8.0、酶解時(shí)間6 h，考察不同加酶量（1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%）對(duì)水解度的影響。

1.3.2.2 pH對(duì)酶解反應(yīng)的影響

固定料液比1:15、溫度50 ℃、加酶量5%、酶解時(shí)間6 h，考察不同酶解pH（7.0、8.0、9.0、10.0、11.0）對(duì)水解度的影響。

1.3.2.3 溫度對(duì)酶解反應(yīng)的影響

固定料液比1:15、pH 8.0、加酶量5%、酶解時(shí)間6 h，考察不同酶解溫度（45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃）對(duì)水解度的影響。

1.3.2.4 時(shí)間對(duì)酶解反應(yīng)的影響

固定料液比1:15、溫度50 ℃、pH 8.0、加酶量5%，考察不同酶解時(shí)間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、10 h）對(duì)水解度的影響。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

在以上單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用 Design-Expert 8.05b軟件中Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，具體選取加酶量、pH、溫度及時(shí)間四個(gè)因素，進(jìn)行提取工藝優(yōu)化研究。

1.3.4 分析測(cè)定方法

1.3.4.1 羅非魚(yú)魚(yú)皮基本組分的測(cè)定

水分：GB 5009.3-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》；灰分：GB 5009.4-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》；總蛋白：GB 5009.5-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；脂肪：GB 5009.6-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》。

1.3.4.2 水解度的測(cè)定

水解度的測(cè)定采用OPA法[15,16]。1.3.4.3 樣品分子量分布的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[17]，利用高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，并用相關(guān)軟件進(jìn)行分析。色譜柱為TSKgel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm，流動(dòng)相為水/乙腈/三氟乙酸（80:20:0.1，V/V/V），在柱溫為室溫、流速為0.5 mL/min條件下，以檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。其中繪制分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線所選取的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為：細(xì)胞色素C(12500 u)、胰島素(5808 u)、桿菌肽(1422 u)、桿菌肽(1422 u)、甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸(451 u)、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(189 u)。

1.3.4.4 膠原蛋白肽粉的感官評(píng)定

參照文獻(xiàn)[18,19]，培養(yǎng)10名感覺(jué)器官機(jī)能良好的檢察人員對(duì)膠原蛋白肽粉從色澤、腥味以及滋味三方面進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，并按照表1填寫(xiě)評(píng)價(jià)表格；對(duì)10名檢查人員的感官評(píng)價(jià)作統(tǒng)計(jì)并計(jì)算分析，分值越小表明測(cè)定結(jié)果越好。

表1 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Index of organoleptic investigation

1.3.4.5 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果以X±S表示。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 羅非魚(yú)魚(yú)皮主要成分分析

羅非魚(yú)皮原料冷凍條件下運(yùn)送至本實(shí)驗(yàn)室后，經(jīng)過(guò)自來(lái)水清洗，瀝干后在室外晾曬，接著低溫干燥并粉碎后備用。羅非魚(yú)魚(yú)皮的化學(xué)組成見(jiàn)表2。

表2 羅非魚(yú)魚(yú)皮的化學(xué)組成Table 2 Nutrient content of tilapia

從表2可以看出，羅非魚(yú)魚(yú)皮水分含量為10.25%、蛋白質(zhì)含量為76.98%、脂肪含量為9.50%，灰分含量為 1.22%?？偟膩?lái)說(shuō)羅非魚(yú)魚(yú)皮蛋白質(zhì)含量很高，很適合高值化利用，但是魚(yú)類加工下腳料常常不可避免的含有脂肪，較高的脂肪含量會(huì)降低蛋白酶的酶解效果，同時(shí)在酶解過(guò)程中脂肪氧化后生成的可溶性小分子醛、酮具有不良?xì)馕?，少量的脂肪殘留在酶解過(guò)濾液中，會(huì)造成產(chǎn)品品質(zhì)下降[20]。

羅非魚(yú)魚(yú)皮脂肪含量偏高，因此在加工過(guò)程中脫脂顯得更加關(guān)鍵。本研究采用具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的低溫連續(xù)相變提取技術(shù)[21]對(duì)羅非魚(yú)魚(yú)皮油脂進(jìn)行提取，參考前期研究得到的最佳提取工藝：萃取時(shí)間50 min，萃取溫度50 ℃，萃取壓力0.5 MPa，解析溫度70 ℃，物料水分為10.25%，此時(shí)提取率達(dá)到90%以上，脫脂后的魚(yú)皮脂肪含量?jī)H為0.70±0.10%，為后期制備高品質(zhì)羅非魚(yú)皮膠原蛋白肽奠定了基礎(chǔ)。

2.2 水解蛋白酶的選擇

分別選取堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶，按照蛋白酶各自的最適作用溫度和pH值，酶解脫脂后的魚(yú)皮原料。不同蛋白酶對(duì)羅非魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白肽水解度、分子量及感官的影響見(jiàn)表3。

從表3可以看出，不同蛋白酶酶解魚(yú)皮后的水解度、分子量分布及感官評(píng)價(jià)有顯著性的差異（p<0.05）。其中風(fēng)味蛋白酶的水解度最高，為 27.07±0.11%，胃蛋白酶的水解度最低，為1.40±0.14%，六種蛋白酶的水解度從高到低排序是風(fēng)味蛋白酶>木瓜蛋白酶>中性蛋白酶>堿性蛋白酶>胰蛋白酶>胃蛋白酶，說(shuō)明風(fēng)味蛋白酶的水解能力最強(qiáng)，同時(shí)其是外切酶，故魚(yú)皮蛋白大部分水解成了多肽或者氨基酸。

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，羅非魚(yú)皮氨基酸組成中相對(duì)分子質(zhì)量最大的氨基酸是酪氨酸（181 u），表明相對(duì)分子質(zhì)量在 180~1000 u之間的物質(zhì)主要是氨基酸殘基在2~8個(gè)之間的小肽（寡肽）[22]，與氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)相比，寡肽更易被機(jī)體吸收且具有獨(dú)特的生物活性[17]。木瓜蛋白酶的分子量 180~1000 u的含量最高，為 72.23±0.46%，胃蛋白酶的含量最低，僅為9.26±0.42%，六種蛋白酶的180~1000 u的含量從高到低排序是木瓜蛋白酶>中性蛋白酶>堿性蛋白酶>風(fēng)味蛋白酶>胰蛋白酶>胃蛋白酶，雖然風(fēng)味蛋白酶的水解度最高，但其分子量 180~1000 u的含量較低，僅為54.56±0.43%。

從產(chǎn)品的角度考慮，不僅水解度要高、分子量分布要合理，感官品質(zhì)還要優(yōu)良。表中不同蛋白酶的色澤沒(méi)有顯著性差異（p>0.05）。腥味是影響品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)之一，木瓜蛋白酶的腥味最大，為4.74±0.07，堿性蛋白酶的腥味最小，為2.36±0.08，六種蛋白酶的腥味從大到小排序是木瓜蛋白酶>中性蛋白酶>胃蛋白酶>風(fēng)味蛋白酶>胰蛋白酶>堿性蛋白酶，說(shuō)明木瓜蛋白酶的腥味最重，但堿性蛋白酶的腥味最小，感官評(píng)價(jià)優(yōu)良。木瓜蛋白酶的滋味最咸，為4.60±0.07，胃蛋白酶的滋味最小，為3.07±0.06，六種蛋白酶的滋味從大到小排序是木瓜蛋白酶>堿性蛋白酶>中性蛋白酶>風(fēng)味蛋白酶>胰蛋白酶>胃蛋白酶。

綜上所述，最終選擇堿性蛋白酶作為最適合的水解用酶，其水解度為18.97±0.09%，分子量180~1000 u的含量為 67.74±0.51%，色澤為 2.45±0.07，腥味為2.36±0.08，滋味為 4.08±0.07。

表3 不同蛋白酶對(duì)羅非魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白肽水解度、分子量及感官的影響Table 3 Effect of protease on hydrolysis degree, molecular weight and organoleptic investigation of collagen peptide from tilapia skin

2.3 加酶量對(duì)酶解反應(yīng)的影響

圖1 加酶量對(duì)水解度的影響Fig.1 Effect of the enzyme concentration on DH

由圖1可知，在加酶量小于6%時(shí)，水解度隨加酶量的增加而增加，在加酶量達(dá)到 6%時(shí)，水解度達(dá)到最大值，在加酶量大于 6%時(shí)，水解度增加緩慢。堿性蛋白酶水解魚(yú)皮的本質(zhì)是蛋白酶分子的絡(luò)合位點(diǎn)與魚(yú)皮蛋白質(zhì)分子中某些特有的氨基酸殘基結(jié)合，其催化位點(diǎn)通過(guò)降低反應(yīng)的活化能而使特有肽鍵容易斷裂和產(chǎn)生。因此，在加酶量為1%~6%時(shí)，魚(yú)皮過(guò)量，酶不夠，即酶已被底物飽和。此時(shí)，隨著酶的增加，蛋白酶與底物蛋白分子接觸并結(jié)合形成酶-底物絡(luò)合物的量也增加，水解度增加。但當(dāng)加酶量達(dá)到6%時(shí)，底物被酶飽和，酶促反應(yīng)速度變緩，水解度增加變緩。因此，選定堿性蛋白酶最適加酶量是6%。

2.4 pH對(duì)酶解反應(yīng)的影響

由圖2可知，pH在5.0~10.0時(shí)，水解度隨pH的增加而增大。當(dāng)pH為10.0時(shí)，水解度達(dá)到最大值，之后繼續(xù)增大pH，水解度開(kāi)始下降。pH在5.0~10.0范圍時(shí)，pH值的增加可促進(jìn)堿性蛋白酶和魚(yú)皮蛋白溶解并使其處于一定的解離狀態(tài)，它能促進(jìn)酶與底物蛋白形成酶-底物絡(luò)合物以及增強(qiáng)蛋白酶活性，從而增強(qiáng)酶解反應(yīng)發(fā)生和水解度的增大；但當(dāng)pH大于10.0時(shí)，此時(shí)蛋白酶和底物蛋白溶解性減弱，酶與底物蛋白形成的蛋白酶-底物絡(luò)合物量減少，蛋白酶甚至變性失活，酶解反應(yīng)減弱，水解度下降。因此，選定堿性蛋白酶最適水解pH為10.0。

圖2 pH對(duì)水解度的影響Fig.2 Effect of the pH value on DH

2.5 溫度對(duì)酶解反應(yīng)的影響

圖3 溫度對(duì)水解度的影響Fig.3 Effect of the enzymolysis temperature on DH

從圖3可知，在45~60 ℃內(nèi)水解度隨溫度升高變化較快，當(dāng)溫度進(jìn)一步升高時(shí)水解度不再升高反而有所下降。在45~60 ℃范圍內(nèi)，溫度的上升能促進(jìn)堿性蛋白酶蛋白酶和魚(yú)皮蛋白的溶解，加強(qiáng)酶與底物的接觸，形成酶-底物絡(luò)合物。同時(shí)，加熱可以降低酶促反應(yīng)所需的活化能，促進(jìn)酶促反應(yīng)的發(fā)生和水解度的增大。當(dāng)溫度高于60 ℃時(shí)，隨著溫度的上升酶變性失活及酶總活性下降，酶與底物蛋白之間的交鏈聚合也加重，聚合物不溶于水，從而削弱底物蛋白的溶解和蛋白酶的活性，水解度降低。因此，選定堿性蛋白酶最適水解溫度為60 ℃。

2.6 時(shí)間對(duì)酶解反應(yīng)的影響

圖4 時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.4 Effect of the enzymolysis time on DH

由圖4可知，在堿性蛋白酶作用下，最初的6 h內(nèi)水解度增加的幅度較大；隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度不斷增大，到6 h時(shí)，水解度趨向穩(wěn)定。此后，隨時(shí)間的延長(zhǎng)水解度變化不大。在6 h內(nèi)，底物含有大量肽鍵，產(chǎn)物對(duì)酶促反應(yīng)的抑制作用很小。蛋白酶變性、自溶和（或）“鈍化”失活的概率較低，它可以促進(jìn)酶-底物絡(luò)合物的形成和水解度的升高。但是時(shí)間超過(guò)6 h時(shí)，肽鍵的數(shù)目減少，產(chǎn)物對(duì)酶促反應(yīng)的削弱作用增強(qiáng)，蛋白酶變性、自溶和（或）“鈍化”失活增加，酶-底物絡(luò)合物的量減少以及水解度增加緩慢。因此，選定堿性蛋白酶最適水解時(shí)間為6 h。

2.7 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面法的要求，選取影響膠原蛋白肽水解度的四個(gè)因素：時(shí)間、加酶量、溫度、pH。采用四因素三水平的響應(yīng)面分析方法，利用Design-Expert 8.05b軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，分析因素與水平設(shè)計(jì)如表4所示。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

經(jīng)過(guò)多元回歸擬合，得到回歸方程模型：

表4 響應(yīng)面分析因素與水平Table 4 Factors and levels of RAS test

表5 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 5 Experiment design and results of response surface

由回歸模型的方差分析可知（表6），該回歸模型達(dá)到極顯著水平(p<0.0001)。由表中P值可知，4個(gè)因子都對(duì)膠原蛋白肽水解度具有顯著性影響。逐項(xiàng)顯著性結(jié)果檢驗(yàn)表明：方程中一次項(xiàng)A、B、C、D，二次項(xiàng)A2、B2、D2及交互項(xiàng)AB對(duì)膠原蛋白肽水解度影響顯著，其余項(xiàng)影響均不顯著。該擬合模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9672，說(shuō)明響應(yīng)值（水解度DH）的變化有96.72%來(lái)源于所選變量，即時(shí)間、加酶量、溫度、pH值。失擬項(xiàng)不顯著(P=0.1671)，說(shuō)明該回歸方程的擬合度高，可較好地描述各因素與響應(yīng)值的真實(shí)關(guān)系。

軟件分析，得出最優(yōu)的堿性蛋白酶水解條件為：時(shí)間7 h、加酶量7%、溫度60 ℃、pH值10.38，在此條件下堿性蛋白酶水解羅非魚(yú)皮的水解度預(yù)測(cè)值為22.78%。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，此最優(yōu)條件下水解度為23.01%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差在1.0%左右，證明在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用該模型進(jìn)行預(yù)測(cè)是可行的。

表6 二次響應(yīng)面方差分析Table 6 ANOVA for response surface quadratic model

2.8 最優(yōu)水解條件的膠原蛋白肽相對(duì)分子量的分布

圖5 酶解產(chǎn)物的高效凝膠液相色譜圖Fig.5 The hydrolysates weight chromatography by HPLC

用最優(yōu)的組合方法酶解魚(yú)皮獲取的膠原蛋白肽為有輕微腥味和較弱苦澀味的白色粉末，酶解產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量分布曲線如圖 5，相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)定結(jié)果如表6。

表7 酶解液分子質(zhì)量分布測(cè)定結(jié)果Table 7 Determination results for the molecular weight distribution of the hydrolysates

由表7可見(jiàn)，分子質(zhì)量在180~1000 u之間的物質(zhì)占 70.70%，即表明酶解液中寡肽含量較高，占比為70.70%，而寡肽具有獨(dú)特的生理活性且更易被機(jī)體吸收。蛋白質(zhì)及多肽因?yàn)槔砘璧K和代謝阻礙等原因需要在胃腸道內(nèi)被降解為2~5個(gè)氨基酸殘基小肽或直接降解成為游離氨基酸才能被吸收。寡肽（主要是二肽和三肽）和氨基酸存在兩種互相獨(dú)立的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，短鏈肽可以通過(guò)兩類肽運(yùn)載體直接吸收進(jìn)入血液，吸收速度快，生物活性顯著[23]。寡肽比大肽更易吸收，寡肽中的二肽和三肽能被完整的吸收，而腸道對(duì)于大于三肽的寡肽的吸收慢于二肽、三肽，且在腸道內(nèi)進(jìn)一步水解為二、三肽后才能被人體完整的吸收利用[24]。但也有研究發(fā)現(xiàn)四肽、五肽甚至六肽都能被吸收[25]。有證據(jù)表明，含有脯氨酸、羥脯氨酸的寡肽易于被吸收進(jìn)入門靜脈并在血液中以完整的形式出現(xiàn)，這些肽對(duì)細(xì)胞內(nèi)肽酶有一定的抵抗力[26]。根據(jù)日本德國(guó)的研究，分子量180~1000 u之間的膠原蛋白肽具有較好的生理活性及能夠被人體很好的吸收和利用，因此廣泛應(yīng)用于保健食品、化妝品、醫(yī)藥行業(yè)作為功能因子有巨大的開(kāi)發(fā)價(jià)值。

3 結(jié)論

本文以羅非魚(yú)魚(yú)皮為原料，研究利用酶法制備膠原蛋白肽制品。測(cè)定了羅非魚(yú)皮的基木組成成分，利用低溫連續(xù)相變萃取技術(shù)對(duì)魚(yú)皮進(jìn)行脫脂處理，脫脂后的魚(yú)皮脂肪含量?jī)H為0.70±0.10%。綜合比較水解度，分子量分布及感官評(píng)價(jià)情況對(duì)蛋白酶篩選確定堿性蛋白酶為最適合的水解酶；再通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)魚(yú)皮膠原肽制備工藝進(jìn)行優(yōu)化酶解的最佳工藝條件為：時(shí)間7 h、加酶量7%、溫度60 ℃、pH值10.38，在此條件下堿性蛋白酶水解羅非魚(yú)皮的水解度最高可達(dá)23.01%。堿性蛋白酶最佳工藝條件生產(chǎn)的膠原蛋白肽經(jīng)評(píng)定小組的感官評(píng)定，結(jié)果為有輕微腥味和較弱苦澀味的白色粉末。對(duì)其分子量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該膠原蛋白肽的分子量分布較好，分子質(zhì)量180~1000 u之間的寡肽（約2~8個(gè)氨基酸殘基）占70.70%。因此，本文為生產(chǎn)魚(yú)皮膠原肽產(chǎn)品提出了新的思路，為其工業(yè)化提供了理論支持。