高固形物濃度對(duì)風(fēng)味蛋白酶催化制備改性大豆分離蛋白功能特性的影響

陳穗，王海萍，崔春

（1.廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司，廣東中山 528437）（2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）具有價(jià)格低廉、蛋白含量高和氨基酸比例均衡等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于食品加工的各個(gè)領(lǐng)域，是目前我國(guó)大豆蛋白市場(chǎng)上產(chǎn)量最大、應(yīng)用最廣泛的一種大豆蛋白產(chǎn)品。但是由于大豆分離蛋白中存在抗原性成分（7S，11S）和蛋白酶抑制因子，直接食用則會(huì)影響其消化吸收，因此限制了大豆分離蛋白的使用。為了解決這種問(wèn)題，目前人們通常以大豆分離蛋白為原料，通過(guò)控制酶解技術(shù)制備改性大豆蛋白(mSPI)[1]、功能性大豆肽[2,3]和高品質(zhì)呈味基料[4]來(lái)達(dá)到高度利用大豆蛋白的目的。酶法改性指的是將蛋白質(zhì)在酶制劑（植物蛋白酶、動(dòng)物蛋白酶或微生物蛋白酶）的作用下，肽鍵斷裂，大分子被切割成小分子，從而形成某些特殊的基團(tuán)，以此來(lái)改善蛋白質(zhì)的某些功能特性[5]。研究表明，影響大豆蛋白酶解反應(yīng)的因素主要有：底物濃度、酶解溫度、酶與底物濃度比、pH值、是否存在激活劑和抑制劑[6～8]。

底物濃度，即固形物濃度，指的是酶解反應(yīng)中底物在酶解體系中所占的比例。一般而言，常規(guī)酶解技術(shù)中底物蛋白質(zhì)的濃度在8%～16%之間。本文中高底物濃度指底物蛋白質(zhì)的濃度在24%～32%之間。與常規(guī)濃度酶解技術(shù)相比，高固形物濃度酶解反應(yīng)具有終產(chǎn)物濃度高、廢水產(chǎn)量少、冷卻和濃縮能耗低、設(shè)備尺寸小等優(yōu)點(diǎn)[9,10]。目前利用蛋白酶酶解技術(shù)對(duì)大豆蛋白改性提高其乳化性、起泡性等功能特性已有較多研究成果，然而迄今為止尚未見(jiàn)高濃酶解技術(shù)對(duì)大豆蛋白進(jìn)行改性的研究報(bào)道。因此，本文擬利用風(fēng)味蛋白酶對(duì)不同濃度的大豆分離蛋白進(jìn)行酶法降解制備系列改性大豆蛋白，探討不同固形物濃度對(duì)大豆蛋白功能特性的影響。

1 材料與方法

1.1 原料

大豆分離蛋白，購(gòu)于山東香馳豆業(yè)科技有限公司；風(fēng)味蛋白酶MG500，中國(guó)諾維信公司提供；金龍魚調(diào)和油為市購(gòu)。

1.2 儀器

Sartorius BP211D分析天平，德國(guó)賽多利斯儀器公司；600高效液相色譜儀，美國(guó)waters公司；KDN-103F微量凱式定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；八孔消化爐，上海纖檢儀器有限公司；LGJ-1冷凍干燥機(jī)，上海醫(yī)用分析儀器廠；UV1810S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司。

1.3 試劑

氫氧化鈉、鹽酸、硼酸、硫酸、硫酸鉀、甲醛、溴甲酚綠、甲基紅、十二烷基磺酸鈉、甘氨酸、β-巰基乙醇、丙烯酰胺、四甲基乙二胺、三羥甲基氨基甲烷、過(guò)硫酸銨、考馬斯亮藍(lán) R-250、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等試劑來(lái)自阿拉丁試劑公司，均為分析純。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 輕度酶解大豆分離蛋白制備不同水解度的改性SPI

分別稱取8、16、24、32 g的大豆分離蛋白，緩慢倒入100 mL的水中，邊倒邊緩慢攪拌，直至將其制成均勻的溶液，將溶液的pH調(diào)到6.5后，添加大豆分離蛋白質(zhì)量1%風(fēng)味蛋白酶，50 ℃分別酶解（搖床震蕩）不同的時(shí)間，水解結(jié)束后沸水浴20 min滅酶，之后快速冷卻酶解液，該過(guò)程對(duì)于酶解液中的蛋白質(zhì)以及酶解之后的肽都會(huì)產(chǎn)生影響，使蛋白質(zhì)發(fā)生部分聚集，從而影響其功能特性，由于未酶解和酶解的蛋白均采取沸水浴滅酶處理，故其影響程度相當(dāng)，且所有的測(cè)定都具有可比性。取部分滅酶后的樣品不離心直接測(cè)定水解度，其余樣品進(jìn)行冷凍干燥，得改性大豆分離蛋白粉，密封于干燥器中備用。

水解度（DH）是水解過(guò)程中斷裂的肽鍵數(shù)占總肽鍵數(shù)的百分比。DH(%)=(水解后生成的α-氨基氮/樣品總氮)×100%。其中，水解后生成的α-氨基氮由甲醛滴定法測(cè)得，樣品總氮由凱氏定氮法測(cè)得。

1.4.2 酶解產(chǎn)物分子量分布測(cè)定

參考 Cui等[8]的方法。采用 TSK-Gel G400sw（7.5*600 mm）分析柱；洗脫液為含0.2 M氯化鈉的50 mmol/L pH 6.8的磷酸鹽緩沖液，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm。柱溫為25 ℃，分析時(shí)間為45 min。

1.4.3 酶解產(chǎn)物溶解性（NSI）測(cè)定

稱取300 mg凍干酶解產(chǎn)物分散于30 mL的去離子水中，用1 mol/L的氫氧化鈉或者鹽酸溶液調(diào)節(jié)酶解產(chǎn)物溶液的pH值，25 ℃攪拌30 min后8000 r/min離心20 min，去除沉淀。用凱氏定氮法測(cè)上清液總氮含量。結(jié)果用氮溶解指數(shù)溶解性（NSI）來(lái)表示，定義為上清液的總蛋白含量與原料總蛋白含量的比值。

1.4.4 分散穩(wěn)定性的測(cè)定

參照王章存等[11]的方法，將凍干蛋白酶解產(chǎn)物配制為濃度1.0 mg/mL溶液，用分光光度計(jì)測(cè)定大豆分離蛋白溶液在280 nm處吸光值，將初始吸光值和10 min后的吸光值分別記為Amax和Amin，二者的比值反映酶解產(chǎn)物的分散穩(wěn)定性，比值越小，說(shuō)明樣品分散越穩(wěn)定。分散穩(wěn)定性%=Amax/Amin×100。

1.4.5 持水力（WHC）的測(cè)定持水力為每克大豆蛋白酶解產(chǎn)物結(jié)合的去離子水的質(zhì)量(g)。參照唐傳核[12]的方法，準(zhǔn)確稱取大豆蛋白酶解產(chǎn)物(0.2 g)于10 mL的離心管中，記離心管和蛋白的總重為W1，緩慢加入4 mL的去離子水，渦旋振蕩分散至無(wú)明顯顆粒，靜置30 min后3000 r/min離心

20 min，倒掉上清液，稱取離心管質(zhì)量記為W2，即蛋白質(zhì)、水、離心管的總重量，持水力計(jì)算公式為：

WHC=(W2-W1)/m。

1.4.6 乳化性的測(cè)定

乳化性測(cè)定方法參照Pearce等[13]的方法并做適當(dāng)?shù)男薷?。將蛋白樣品配制?%樣品溶液9 mL，水化30 min，加入3 mL玉米油，10000 r/min高速剪切2 min，制成乳化液。然后立即在燒杯底部吸取 50 μL乳狀液，加入至5 mL 0.1% SDS溶液中，渦旋振蕩混合均勻。以0.1% SDS溶液為空白，測(cè)定500 nm下吸光值。蛋白乳化性以乳化活力指數(shù)EAI表示：

EAI(m2/g)=(2×2.303×A500/(φ×L×C))×N×10-4

其中，EAI是每克蛋白質(zhì)的乳化面積（m2/g）；φ：體系中油相所占的體積分?jǐn)?shù)（本實(shí)驗(yàn)中為0.25）；N：稀釋倍數(shù)（本實(shí)驗(yàn)中為100）；C：蛋白濃度（g/mL）；L：比色池光徑（1 cm）。

1.4.7 起泡性和起泡穩(wěn)定性的測(cè)定

參照 MartaCorzo-Martínez[14]的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定。

1.4.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有測(cè)定數(shù)據(jù)重復(fù)三次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，使用SPSS 16和EXCEL軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 固形物濃度對(duì)mSPI蛋白分子量分布的影響

圖1 固形物濃度對(duì)改性大豆分離蛋白酶解產(chǎn)物分子量分布的影響Fig.1 Influence of the solid concentration on the molecular weight distribution of the SPI hydrolyzate by Flavourzyme

固形物濃度對(duì)mSPI分子量分布的影響規(guī)律見(jiàn)圖1。圖1a為不同水解度下，8%和32%濃度下mSPI的分子量分布圖。由圖1a可見(jiàn)隨著水解度的增大，mSPI中大分子的肽段含量逐漸減少，小分子肽段的含量逐漸增多。在固形物濃度為8%時(shí)，當(dāng)水解度從7%增大為10.3%時(shí)，水解產(chǎn)物中分子量小于10 ku的肽段含量從34.37%增長(zhǎng)為42.64%。圖1b為相同水解度下，不同固形物濃度對(duì)mSPI分子量分布的影響。由圖1b可見(jiàn)，在水解度相同的條件下，在8%和16%濃度下mSPI的分子量分布差異較小，當(dāng)固形物濃度達(dá)到24%和32%時(shí)，mSPI中小于10 ku的肽段組分含量減小。這表明高濃體系條件下制備的mSPI中小分子組分明顯低于低濃體系，這可能是因?yàn)樵诟邼鈼l件下體系粘度大物質(zhì)交換受到阻礙，限制了大分子物質(zhì)的降解

[15]。

2.2 固形物濃度對(duì)mSPI溶解性的影響

圖2 固形物濃度對(duì)風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物溶解性的影響Fig.2 Influence of the solid concentration on the NSI of the SPI hydrolyzate by Flavourzyme

溶解性(NSI)是SPI的重要功能特性之一，是其乳化性、起泡性和凝膠性等其他功能特性的基礎(chǔ)，而蛋白質(zhì)酶解是提高蛋白溶解性的常用手段。一般而言，pH值是影響蛋白溶解性的重要因素之一，大豆分離蛋白在其等電點(diǎn)附近溶解性很低，這就限制了其在酸性食品如飲料、酸奶等中的應(yīng)用，因此提高大豆蛋白在酸性條件下的溶解性成為大豆蛋白改性研究的熱點(diǎn)。圖2為不同固形物濃度不同水解度下制備的mSPI在中性和酸性條件（pH 7.0，pH 4.0）下溶解性。

由圖2可知，在中性條件下和酸性條件下，風(fēng)味蛋白酶制備的mSPI的溶解性與水解度呈正相關(guān)，且與酶解體系的固形物濃度無(wú)關(guān)，在同一水解度條件下，隨著底物濃度的增加，溶解性并未呈現(xiàn)顯著性變化。這與Hardt等人利用風(fēng)味蛋白酶酶解小麥面筋蛋白的研究結(jié)果一致[16]。mSPI在中性條件下溶解性由原料的 40.7%提高到 54.6%（DH7%）和 64.25%（DH10.87%），分別提高了34.5%和58.3%。在酸性條件下時(shí)，溶解性分別由原料的 27%提高到 47.54%（DH7.00%）和 56.16%（DH10.87%），分別提高了76.1%和1.08倍。這主要是因?yàn)镾PI在風(fēng)味蛋白酶的催化下SPI的肽鍵斷裂，形成許多小分量的寡肽及多肽，極性增大。

2.3 固形物濃度對(duì)mSPI分散穩(wěn)定性的影響

圖3 固形物濃度對(duì)風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物分散穩(wěn)定性的影響Fig.3 Influence of the solid concentration on the dispersion stability of the mSPI by flavourzyme

目前文獻(xiàn)中對(duì)mSPI功能特性的研究往往局限于其可溶性部分，而實(shí)際上，mSPI只要在水中有很好的分散性就可大大拓展其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用，如用于肉脯、火腿腸等凝膠型食品和蛋白飲料等液體型食品的開(kāi)發(fā)中。圖3a、3b為mSPI在中性和pH 4.0條件下的分散穩(wěn)定性圖。由圖3可見(jiàn)，在同一固形物濃度下，隨著水解度的增大，mSPI在中性和酸性環(huán)境下分散穩(wěn)定性均增大，這主要是因?yàn)槊附庠缴?，蛋白分子越小，在水中分散性越好，易溶于水而不至于沉淀。其中，在酸性條件下隨水解度增大，mSPI分散穩(wěn)定性增加最為明顯。24%濃度下制備得到的mSPI，其分散穩(wěn)定性為83.63%（DH10.87%）為原料的1.55倍。此外，無(wú)論是在中性還是酸性條件，mSPI的分散穩(wěn)定性隨著酶解固形物濃度的增加而提高（無(wú)顯著性差異）。這與王章存等研究固形物濃度對(duì)堿性蛋白酶酶解小麥面筋蛋白分散性的結(jié)論一致。

2.4 固形物濃度對(duì)mSPI持水力的影響

由圖4所示，SPI原料的持水性最高，改性大豆分離蛋白的持水力均低于原料蛋白。原料蛋白持水力為4.26 g/g；mSPI（固形物濃度32%，DH6.47%）的持水力為 4.19 g/g。這主要是因?yàn)榇蠖狗蛛x蛋白在復(fù)水時(shí)形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而經(jīng)過(guò)酶解作用后，小分子肽增多，不利于形成蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而持水力下降[17]。此外，隨著水解度的增大，mSPI的持水力呈下降趨勢(shì)，而在相同水解度下，隨著酶解固形物濃度的提高，mSPI的持水力呈上升趨勢(shì)。其原因是高濃度條件下，酶解產(chǎn)物中大分子量的蛋白質(zhì)和多肽含量更多。

圖4 固形物濃度對(duì)風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物持水力的影響Fig.4 Influence of the solid concentration on the water binding capacity of the SPI hydrolyzate by Flavourzyme

2.5 固形物濃度對(duì)mSPI乳化性的影響

圖5 固形物濃度對(duì)風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物乳化活性的影響Fig.5 Influence of the solid concentration on the emulsifying ability of the SPI hydrolyzate by Flavourzyme

表面活性是大豆分離蛋白最基本的性質(zhì)之一，而乳化性是其非常重要的表現(xiàn)形式，它可以吸附在油水界面，降低界面張力，在油水混合時(shí)起到乳化的作用，形成多分散體系，這主要是由蛋白質(zhì)分子鏈內(nèi)部分布的親水或疏水基團(tuán)所決定的。

由圖5可知，mSPI的乳化活性低于原料蛋白，且水解度越大乳化活性越低。這是因?yàn)殡S著水解度的提高，大分子蛋白降解為小分子多肽，親水性基團(tuán)大量暴露而疏水性基團(tuán)被破壞，使得油滴表面的保護(hù)層變薄，產(chǎn)物乳化性降低。由于高濃環(huán)境下，分子之間的空間較為擁擠，限制了大分子蛋白分解為小分子肽，因而其產(chǎn)物乳化活性高于低濃環(huán)境下的酶解產(chǎn)物。

2.6 固形物濃度對(duì)酶解產(chǎn)物起泡性和起泡穩(wěn)定性的影響

圖6 固形物濃度對(duì)風(fēng)味蛋白酶酶解產(chǎn)物起泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.6 Influence of the solid concentration on the foaming capacity of the SPI hydrolyzate by Flavourzyme

固形物濃度對(duì)改性大豆分離蛋白起泡性和起泡穩(wěn)定性的影響如圖6所示。由圖6a可知原料大豆分離蛋白起泡性較差，而酶解產(chǎn)物起泡性均有所提高，且隨著水解度的提高，起泡性大致呈先升高再降低的趨勢(shì)，而最佳水解度的差異可能與原料的不同及水解度測(cè)定方法差異有關(guān)。酶解初期起泡性升高主要是因?yàn)橐耗さ男纬墒堑鞍踪|(zhì)肽鏈相互作用的結(jié)果，蛋白分子在酶的作用下肽鏈展開(kāi)，溶解性提高，更多的肽參與到液膜的形成，從而使得起泡性增強(qiáng)。而隨著水解度的進(jìn)一步提高，形成的肽鏈越小，不足以穩(wěn)定液膜，泡沫易破裂，起泡性隨之降低。此外，起泡性的高低與可溶性蛋白的含量、分子量、結(jié)構(gòu)等密切相關(guān)，是多種影響因素共同作用的結(jié)果。

當(dāng)水解度＜8%時(shí)，低濃度酶解產(chǎn)物起泡性高于高濃，而水解度超過(guò) 8%時(shí)，高濃酶解產(chǎn)物起泡性大體高于低濃酶解產(chǎn)物?？赡艿脑蚴牵退舛认?，低濃酶解產(chǎn)物溶解性較高，分子量小于高濃，蛋白質(zhì)分子大小合適，當(dāng)水解度進(jìn)一步增大時(shí)，低濃條件下蛋白分子過(guò)小而高濃由于酶解受到限制而獲得合適大小的蛋白質(zhì)分子而具有較高起泡性。

通過(guò)圖6b可知，酶解處理降低了大豆分離蛋白的泡沫穩(wěn)定性，且高濃條件下酶解產(chǎn)物泡沫穩(wěn)定性高于低濃，其原因可能是酶解使得產(chǎn)物中小分子肽段增多，疏水基團(tuán)暴露導(dǎo)致液膜變得脆弱，且小分子肽段的形成增加了蛋白分子電荷量，靜電作用阻礙蛋白質(zhì)分子的吸附作用，從而使得泡沫穩(wěn)定性下降。

3 結(jié)論

本文利用風(fēng)味蛋白酶酶解不同固形物濃度的大豆分離蛋白，并對(duì)酶解產(chǎn)物的功能特性進(jìn)行了分析，結(jié)論如下：

（1）大豆分離蛋白經(jīng)過(guò)風(fēng)味蛋白酶控制酶解制備的mSPI，其產(chǎn)物溶解性、分散穩(wěn)定性、起泡性均提高，持水力、乳化性、起泡穩(wěn)定性降低。

（2）在相同水解度下，隨著固形物濃度的提高，mSPI的分散穩(wěn)定性、持和水力和乳化性均呈上升趨勢(shì)。當(dāng)水解度＜8%時(shí)，低濃度酶解產(chǎn)物起泡性高于高濃，而水解度超過(guò) 8%時(shí)，高濃酶解產(chǎn)物起泡性大體高于低濃酶解產(chǎn)物，而就起泡穩(wěn)定性而言前者也高于后者，以上說(shuō)明高濃和常濃狀態(tài)酶解模式存在差異性。

（3）風(fēng)味蛋白酶催化制備的mSPI的溶解性與酶解固形物濃度無(wú)明顯關(guān)系。