硫化氫（H2S）熏蒸對葡萄損傷接種黑曲霉的抑制及其采后品質(zhì)的影響

張磊，魏佳，張政，吳斌

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊 830052）（2.新疆農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，新疆烏魯木齊 830091）

無核白葡萄(Vitis viniferaL. cvThompson Seedless)又名“無籽露”，皮薄肉脆，汁多味甜，品質(zhì)優(yōu)良[1]。但無核白葡萄不耐貯藏，易受病原菌侵染而腐爛變質(zhì)。黑曲霉引起的真菌病害是葡萄常見的采后病害，黑曲霉為常溫優(yōu)勢菌，葡萄果穗部位的傷口處易被感染，使健康葡萄組織褐色軟腐，感染部位先長出白色菌絲后變成黑色的成熟分生孢子[2]。同時葡萄貯藏期間也易發(fā)生果實軟化、果梗褐變、果粒脫落腐爛等現(xiàn)象，導致葡萄品質(zhì)的下降，造成巨大經(jīng)濟損失[3]。

硫化氫（Hydrogen sulfide，H2S）是繼一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）被發(fā)現(xiàn)之后的又一種新型氣體信號分子[4]。近年來，越來越多的研究顯示，H2S作為信號分子參與了植物體中的多種生理作用，如調(diào)節(jié)氣孔運動、增強植物耐熱性、延緩植物衰老、增強植物抗菌性等方面[5～7]。但 H2S是否在果蔬的貯藏保鮮和病害預防中發(fā)揮著重要作用至今還不清楚。已有研究表明，采用H2S供體NaHS處理甘薯能夠抑制黑腐病和軟腐病，并有效緩解了甘薯的衰老和腐爛[8]。H2S還能夠有效抑制梨黑曲霉和青霉的生長，且延長了梨的保質(zhì)期，有效保持了果實的貯藏品質(zhì)[9]。Hu等人[10]證明H2S延緩草莓衰老所需濃度是很低的，表明低濃度H2S熏蒸水果是食用安全可行的。目前，H2S在果蔬貯藏保鮮中的研究主要以NaHS水溶液處理方式為主，這種一段式釋放方式不易控制氣體濃度和應用，如何精準控制H2S熏蒸方式是果蔬保鮮方面應用研究的難點。

熏蒸技術是利用熏蒸劑殺死果皮表面病菌，從而降低果實發(fā)病率、延長貯藏期。H2S間歇熏蒸采用短時多次的熏蒸方式，可以降低高濃度氣體對果實造成的傷害，也有利于氣體濃度的精準調(diào)控。目前在果蔬保鮮貯藏方面已有相關應用。前期課題組發(fā)現(xiàn)NO間歇熏蒸處理木納格葡萄，可延緩果實的衰老，維持貯藏品質(zhì)[11]。SO2間歇熏蒸處理紅地球葡萄，避免了高濃度SO2氣體長時間處理對果實的傷害[12]。因此，間歇熏蒸這種新型處理方式體現(xiàn)了它的優(yōu)勢性。

外源H2S氣體誘導處理對葡萄果實品質(zhì)和貯藏特性影響的研究目前尚未見報道。為此，本文以新疆無核白葡萄果實為試材，研究了H2S處理對其采后黑曲霉病害的控制及果實貯藏品質(zhì)的影響。為H2S處理在葡萄果實采后保鮮中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與菌種

黑曲霉（Aspergillus niger）新疆農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所；無核白葡萄（Vitis vinifera L. var Thompson Seedless），于2017年7月采自吐魯番，挑選大小均一、無機械損傷、無病蟲害的葡萄果實，采后當日置于（0±1）℃實驗室冷庫中進行預冷處理，預冷時間24 h后待用。

1.2 試劑與儀器

硫化氫（H2S）氣體（氣體純度為99.99%），廣州世源氣體有限公司；L-苯丙氨酸，廣州市江順化工科技有限公司；愈創(chuàng)木酚、Triton X-100，天津市光復精細化工研究所；三氯乙酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇6000、鄰苯二酚，天津市致遠化學試劑有限公司；30%過氧化氫、抗壞血酸、酚酞，天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司；乙二胺四乙酸、β-巰基乙醇、丙酮、氫氧化鈉，天津市福晨化學試劑廠；以上試劑均為國產(chǎn)分析純。

DELTA320分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SIM-F140ADL制冰機，日本松下電器；UV-2600型分光光度計，日本島津；DW-86L626 80 ℃超低溫冰箱，青島海爾特種電器有限公司；IKA⑧A11基本型研磨機，廣州儀科實驗室技術有限公司；GY-4硬度計，北京市興光測色儀器公司；PAL-1數(shù)顯折射儀，日本Atago公司；Centrifge 5810 R型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 H2S熏蒸處理

預實驗采用不同H2S濃度（50，250，500，750，1000 μL/L）間歇熏蒸處理葡萄，然后損傷接種黑曲霉，發(fā)現(xiàn)500 μL/L的H2S處理對黑曲霉病斑直徑和果實病情指數(shù)的抑制效果最好，篩選出H2S對葡萄果實病害控制的適宜濃度為500 μL/L。故此后續(xù)試驗都采用該濃度，將18 kg葡萄隨機分成6份，每份約重0.5 kg，置于30 L的熏蒸裝置中，密閉后將H2S氣體注入熏蒸裝置中使其濃度為500 μL/L，同時將裝置內(nèi)的小風扇打開，然后立即關閉進氣孔密閉3 h后取出。從第0 d開始熏蒸，每隔24 h在常溫下熏蒸一次，共熏蒸5次。每次熏蒸結(jié)束后立即取樣，共6次。另有18 kg葡萄未經(jīng)處理為對照組，將處理后的葡萄果實置于常溫貯藏。

1.3.2 黑曲霉孢子懸浮液的配制

參考 Bi等人[13]方法進行修改，將純化好的黑曲霉接種到PDA培養(yǎng)基中，于25 ℃培養(yǎng)7 d后，用無菌水將孢子洗下，再用滅菌的雙層紗布過濾，最后用血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)，并且調(diào)節(jié)濃度將菌懸液稀釋至1×106個/mL，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 果實損傷接種

熏蒸后的葡萄放置24 h后，每盒選取15顆葡萄對其進行黑曲霉損傷接種，先用75%的酒精溶液擦拭果實表面需要接種的位置，然后在果實赤道部位用滅菌針刺尺寸深2 mm、直徑2 mm的孔，用微量移液槍向孔中注入15 μL預先配制好的孢子懸浮液。接種結(jié)束后將葡萄果粒分裝到塑料盒（175×135×76 mm）中，每個盒子有6個直徑1 cm的孔。盒內(nèi)放置保鮮紙，密閉后套上保鮮袋置于25 ℃條件下貯藏6 d（果實在第6 d腐爛嚴重，故取樣至第5 d），每24 h觀察果粒的病情指數(shù)和病斑直徑。同時避開果實病斑，取健康果肉樣品，切碎混勻后用液氮速凍并置于-80℃保存待測。

1.3.4 果實病情指數(shù)和病斑直徑測定

病情指數(shù)（disease index，DI）參照吳斌等[14]的方法；病斑直徑利用游標卡尺進行十字交叉法測定，每個病斑測量3次，計算平均值作為其測量值。

1.3.5 果實失重率、落粒率、腐爛率測定

采用稱重法測定葡萄的質(zhì)量失重率、落粒率、腐爛率，重復測定3次。計算公式如下：

1.3.6 果實硬度、可溶性固形物、可滴定酸、抗壞血酸含量的測定

葡萄果實的硬度測定采用GY-4型硬度計；可溶性固形物（TSS）含量測定采用PAL-1型數(shù)顯折射儀測定；可滴定酸（TA）采用酸堿中和滴定法[15]；抗壞血酸含量測定參照鉬藍比色法測定[15]。各處理平行重復測定3次。

1.3.7 果實葉綠素含量的測定

采用丙酮提取法[16]進行測定。

1.3.8 果實防御相關酶活性的測定

過氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）活性的測定參考曹建康等[15]的方法，苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性參照Mei[17]等的方法，略有改動。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Sigma Plot 12.0軟件作圖，SPSS 19.5進行數(shù)據(jù)方差分析并利用 Duncan法進行均值比較。p＜0.05表示差異顯著，p＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2S處理對葡萄果實病情指數(shù)與病斑直徑的影響

病情指數(shù)和病斑直徑是影響葡萄果實貯藏期長短的主要因素，是判斷果蔬保鮮效果的重要依據(jù)之一[18]。如圖1所示，葡萄果實在接種黑曲霉后2 d才開始發(fā)病，隨著時間的延長，葡萄果實的病情指數(shù)呈不斷上升趨勢，H2S處理能夠延緩接種葡萄果實病斑面積的擴大，在25 ℃條件下貯藏6 d后，H2S處理組果實病情指數(shù)為0.88（圖1a），顯著低于對照組的0.92（p＜0.05）。葡萄果實接種黑曲霉后，病斑直徑隨貯藏時間的推移逐漸增大。在整個貯藏期間，H2S處理組果實的病斑直徑始終低于對照果實。H2S處理可顯著抑制果實病斑的擴展，在25 ℃條件下貯藏至第3 d，H2S處理組和對照組葡萄果實的病斑直徑分別為10.8 mm和14.3 mm（圖1b），H2S處理組果實的病斑直徑比對照果實低了24.5%（p＜0.01）。

圖1 H2S處理對葡萄果實病情指數(shù)（a）和病斑直徑（b）的影響Fig.1 Effects of H2S treatment on disease index (A) and lesion diameter (B) of grapes during storage

2.2 H2S處理對葡萄果實失重率、落粒率、腐爛率的影響

蒸騰失水是導致果蔬貯藏期間失重的主要原因之一[19]。葡萄貯藏過程中，隨著時間的延長，果實營養(yǎng)物質(zhì)損失和受霉菌侵染，造成葡萄果粒脫落和果實腐爛變質(zhì)[20]。

由表1可以看出，在整個貯藏期間，葡萄的失重率呈上升趨勢，且H2S處理組失重率始終低于對照組，貯藏至第5 d，對照組失重率為H2S處理組的1.39倍（p＜0.01）；葡萄的落粒率在整個貯藏期間呈上升趨勢，且H2S處理組落粒率顯著低于對照組（p＜0.01）；在葡萄整個貯藏期間，其腐爛率總體來說呈現(xiàn)上升趨勢，貯藏至第2 d，葡萄果實才開始腐爛，但對照組腐爛率顯著高于H2S處理組（p＜0.01），但在貯藏至3～5 d，對照組和 H2S處理組的腐爛率差異不是很大（p＞0.05）。這表明H2S可以抑制葡萄質(zhì)量損失率的上升，緩解葡萄果實的落粒，降低腐爛率。

表1 H2S處理對葡萄果實失重率、落粒率和腐爛率的影響Table 1 Effects of H2S treatment on weight loss rate, drop rate and decay rate of grapes during storage

2.3 H2S處理對葡萄果實硬度、TSS、TA、抗壞血酸含量的影響

圖2 H2S處理對葡萄果實硬度（a）、可溶性固形物（b）、可滴定酸（c）和抗壞血酸（d）的影響Fig.2 Effects of H2S treatment on hardness (a), soluble solids (b),titratable acid (c) and ascorbic acid (d)of grapes during storage

果實硬度是葡萄采后耐貯性的重要品質(zhì)之一，而軟化的果實容易受機械損傷和病菌感染[21]。由圖 2a可知，葡萄采后隨著貯藏時間的延長逐漸軟化，硬度迅速下降，H2S處理組跟對照組葡萄的硬度在采后前2 d變化不大，從第3 d開始，對照組的葡萄的硬度顯著低于H2S處理組(p＜0.01)。說明H2S處理能夠延緩葡萄果實的成熟軟化。

果蔬樣品中的可溶性固形物（TSS）主要是可溶性糖，其含量與果蔬的呼吸強度和品質(zhì)狀況相關[22]。由圖2b可知，葡萄果實中TSS含量隨著貯藏時間的延長而逐漸降低，第1 d和第2 d，對照與H2S處理組無顯著差異（p＞0.05），從第3 d開始，對照組TSS含量的下降速度明顯高于H2S處理組(p＜0.05)，說明H2S能夠較好的抑制TSS含量的下降。

可滴定酸（TA）作為果蔬呼吸底物會隨著貯藏時間的延長被消耗，同時也是重要的呈味物質(zhì)[22]。如圖2c所示，葡萄果實中的TA含量在貯藏期間整體呈先上升后下降的趨勢。由于葡萄果實中的有機物被消耗分解，使其TA含量短時間內(nèi)增加，H2S處理組在第2 d達最大值。而處理組TA含量高峰推遲了1 d，但其含量依然低于H2S處理組，隨貯藏時間的延長，果實呼吸作用持續(xù)進行，有機酸含量逐漸降低。在整個貯藏期間，除了第3 d外，H2S處理組TA含量均顯著高于對照組(p＜0.05)。結(jié)果表明，H2S能夠較好的維持TA含量。

抗壞血酸含量與水果的品種、成熟度、耐貯性和貯藏條件有關，是水果營養(yǎng)價值的重要組成部分[23]。從圖2d可以看出，貯藏期間，葡萄果實中的抗壞血酸含量呈下降趨勢，且H2S處理組抗壞血酸含量始終高于對照組，貯藏至第1 d和第4 d，H2S處理組抗壞血酸含量分別是對照組的1.19和1.21倍(p＜0.01)。結(jié)果表明，H2S對葡萄抗壞血酸的損失起到較好的保護作用。

2.4 H2S處理對葡萄果實葉綠素含量的影響

圖3 H2S處理對葡萄果實葉綠素的影響Fig.3 Effects of H2S treatment on chlorophyllof grapes during storage

葉綠素是與果蔬采后商品性狀密切相關的重要色素之一[24]。H2S處理對葡萄果實葉綠素含量的影響如圖3所示，貯藏期間，葡萄果實中的葉綠素含量呈下降趨勢，且H2S處理組葉綠素含量始終高于對照組，在貯藏第2 d和第4 d，H2S處理組葉綠素含量分別高于對照組28.16%和35.4%(p＜0.01)。說明H2S能有效維持果實葉綠素含量。

2.5 H2S處理對葡萄果實防御相關酶活性的影響

過氧化物酶（POD）是植物體內(nèi)重要的抗病防御相關酶，在病害防御方面發(fā)揮著重要作用[25]。圖 4a表明，經(jīng)接種黑曲霉后，POD活性在整個病害觀察期均呈先逐漸升高后下降的趨勢，接種后第2 d，H2S處理組POD活性出現(xiàn)高峰后緩慢下降，而對照組POD活性在第3 d出現(xiàn)高峰后快速下降，尤其接種第4 d后，H2S處理組POD活性下降速率顯著大于對照組（p＜0.01）。表明H2S能夠較好的抑制POD活性的下降。

圖4 H2S處理對葡萄果實在貯藏期間POD（a）、PPO（b）和PAL（c）活性的影響Fig.4 Effects of H2S treatment on of POD (a), PPO (b) and PAL(c) activities of grapes during storage

多酚氧化酶（PPO）是一種能夠催化酚類生成醌類的氧化酶，當果蔬組織受到逆境脅迫或病原菌侵染時，PPO會快速上升來保護果蔬組織[26]。如圖4b所示，接菌后葡萄的PPO活性總體上呈先升高后降低的變化趨勢。在第3 d，兩者同時達到最大值，此時H2S處理組的PPO活性高出對照組15.24%（p＜0.05），隨后處理組與對照組的PPO活性均開始下降，但處理組的PPO活性始終高于對照。說明H2S處理可提高葡萄果實PPO的活性。

苯丙氨酸解氨酶（PAL）是苯丙烷途徑中的關鍵酶和限制酶，其活性的高低直接與寄主的抗性強弱有密切的關聯(lián)[27]。由圖4c可知，H2S處理組和對照組的PAL活性整體上均呈先上升后降低再上升的變化趨勢。接種后第1 d，對照組便出現(xiàn)小峰，而處理組PAL活性不斷升高，于第2 d出現(xiàn)峰值，此時為對照PAL活性的 2.75倍，且差異性顯著（p＜0.01）。之后對照組PAL活性緩慢上升，而對照組PAL活性先下降后快速上升。貯藏期間處理組PAL活性始終高于對照。H2S處理不僅增強了果實PAL活性，并使其維持相對較高水平。

3 討論

近年來，研究發(fā)現(xiàn)H2S作為一種新型氣體信號分子，可誘導采后果蔬產(chǎn)生抗病性。如H2S對草莓灰霉病的主要致病菌包括釀酒酵母、黃綠青霉和梨形毛酶均有較強的抑制作用[28]。H2S抑制了采后桃果實褐腐菌菌斑直徑和果實病斑直徑的擴展[29]。本文中，H2S熏蒸能夠有效控制常溫條件下葡萄采后黑曲霉的生長，顯著降低了果實的病情指數(shù)，抑制了病斑直徑的擴展。這可能是由于H2S直接誘導黑曲霉ROS產(chǎn)生以及過量的 ROS導致氧化損傷對菌絲生長和孢子萌發(fā)起到關鍵作用[30]。

H2S處理的葡萄果實失重率、落粒率、腐爛率與對照組相比顯著下降，明顯降低果實硬度、TSS、TA和抗壞血酸含量下降的速度，保持了果實葉綠素含量。從而延緩葡萄果實采后衰老速度，延長其貯藏時間。H2S可作為果蔬保鮮劑，明顯延緩西蘭花、萵筍、蘋果、番茄、哈密瓜等鮮切果蔬的萎蔫失水、成熟、衰老和霉變，維持采后果蔬的品質(zhì)特性，延長其貯藏期[31]。采后H2S處理可以抑制獼猴桃失重率、硬度、TSS、TA、抗壞血酸和葉綠素含量的下降，延緩了獼猴桃成熟和衰老進程[32]。H2S處理還能顯著降低貯藏過程中桃果實腐爛率和失重率，延緩TSS的升高和硬度的下降，從而延緩果實的軟化進程，顯著延長采后桃果實的貨架期和貯藏期[33]。這與本實驗的研究結(jié)果相一致。

POD、PPO活性的增強對于采后果實抗病性的增強具有重要作用。1-MCP誘導紅富士蘋果抗病過程中，POD、PPO活性顯著升高[25]。Tang等[8]研究發(fā)現(xiàn)H2S處理甘薯顯著提高 POD的活性，從而增強了甘薯的抗病性，有效緩解了甘薯的衰老和腐爛。H2S處理還能增強采后鮮切梨 POD活性，阻止了黑曲霉和青霉病原菌的進一步生長[35]。這與本試驗結(jié)果一致，在本研究中，采后H2S處理明顯增強了葡萄果實POD、PPO防御酶的活性，這可能是因為H2S誘導了木質(zhì)素、植保素等抗性物質(zhì)的形成，增強酚類物質(zhì)氧化能力，生成對病原微生物有毒性作用的醌類物質(zhì)[34]。PAL是苯丙烷代謝途徑的關鍵酶和限速酶。馬鈴薯[36]和甜瓜[37]抗病性的增強都伴隨著 PAL活性的上升。本研究表明H2S處理誘導了葡萄果實PAL活性的上升，可能是H2S可以誘導苯丙烷代謝系統(tǒng)，激活抗病代謝產(chǎn)物的生成，如酚類、類黃酮類、木質(zhì)素和植保素等，從而提高果實的抗病性[34]。這與張暢[29]在桃果實上的研究結(jié)果一致。但H2S對病害控制的分子機理尚不清楚，有待后續(xù)實驗進一步研究。

4 結(jié)論

綜上所述，H2S氣體熏蒸處理顯著降低了損傷接種黑曲霉無核白葡萄果實的病斑直徑和病情指數(shù)，明顯誘導了果實體內(nèi)POD、PPO、PAL等防御酶活性的增強。有效抑制了失重率、落粒率、腐爛率的上升，顯著降低了果實硬度、TSS、TA和抗壞血酸含量下降的速度，保持了果實葉綠素的含量。從而延緩葡萄果實采后衰老進程，提高果實的采后抗病性和貯藏品質(zhì)。由此表明，500 μL/L H2S處理在一定程度上能夠增強葡萄果實的抗病性，還能提高葡萄果實的貯藏品質(zhì)。