代代花化學(xué)成份的分離鑒定和抗氧化活性研究

王天星，姜建國

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

代代花（Citrus aurantium L. var.amara Engl.）屬于蕓香科柑橘亞屬植物，其作為藥食兩用資源在中國被廣泛使用[1]。古代中國人發(fā)現(xiàn)其具有行氣寬中、消食、祛痰的功能[2]，中醫(yī)稱之為福壽草。代代花具有強心、利尿、鎮(zhèn)靜及減慢心率的功能，能降低神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性和脊髓反射機能亢進，用于急性病和慢性心功能不全。另外，由于代代花茶的美容功效，使其在中國成為一種很受歡迎的飲料。

經(jīng)實驗證實，代代花中主要含有揮發(fā)油類、黃酮類及生物堿類，同時含有強心苷和非強心苷、維生素類、香豆素類以及人體必需氨基酸。相關(guān)文獻報道其具有抗氧化[3]、抗炎[4]、抗動脈粥樣硬化[5]、抗腫瘤[6]、抗病毒[7]、促進腸胃動力和降血脂[8]等藥理作用。目前，代代花的研究主要集中于揮發(fā)油類化合物，對其他活性成分及其藥理作用鮮有報道。研究表明柑橘屬植物中黃酮和揮發(fā)油等有效活性成分具有很好的抗氧化作用，然而從代代花中分離得到的單體化合物的抗氧化作用研究少之又少[9]。目前關(guān)于代代花有效活性成分的抗氧化作用的研究主要集中于代代花總黃酮等非單一成分[10]。

以探索更多代代花單體化合物的抗氧化作用為出發(fā)點，本文采用傳統(tǒng)柱層析分離技術(shù)和現(xiàn)代高效液相制備色譜技術(shù)相結(jié)合的方法對代代花全草進行了化學(xué)成分分析。采用DPPH法、ABTS+·法、鐵氰化鉀還原法、FRAP法四種抗氧化能力測定方法，對單體化合物進行抗氧化藥效實驗研究，評價三者對DPPH·自由基和 ABTS+·自由基的清除能力，赤血鹽的還原能力以及對Fe3+的還原能力，從而評價單體化合物的總體抗氧化活性。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

U300型Thermo高效液相色譜儀；FA1104N型電子分析天平；101AB-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱；數(shù)控超聲波清洗器；HH-2型5000 mL電熱套；SB-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；SHZ-DⅢ型循環(huán)水式真空泵；HWS12型電熱恒溫水浴鍋；多功能酶標(biāo)儀；ZF-2型三用紫外儀；DBS-100電腦全自動部分收集器；AVANCEⅢHD600型超導(dǎo)核磁共振波譜儀。

1.2 試劑

DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS（2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）、TPTZ（三吡啶基三嗪）均購于美國Sigma公司；代代花（產(chǎn)自浙江黃巖，購買于廣州清平藥材市場；經(jīng)中國科學(xué)院華南植物園鄧云飛研究員鑒定）；代代花單體化合物（實驗室自制）。甲醇、乙腈為色譜純；水為純凈水；其余試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 單體化合物的提取與分離純化

新鮮干燥的代代花全草適當(dāng)粉碎過篩，稱取3 kg置于5000 mL圓底燒瓶中，按料液比1∶15，用體積分?jǐn)?shù)85%的乙醇分批次加熱回流提取，每批次重復(fù)三次，每次2 h。合并提取液，3000 r/min速度下離心12 min，取上層清液，將上層清液濃縮至棕褐色浸膏狀。將代代花粗提浸膏用適量蒸餾水溶解，依次用等體積的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取3次。將氯仿萃取液濃縮干燥，得到氯仿部位干燥樣品13.3 g。經(jīng)200～300目硅膠柱層析，采用氯仿-甲醇洗脫系統(tǒng)，得到洗脫比例依次為 100∶0、100∶3、100∶5、100∶8、100∶10的五個組分。組分3（100∶5）經(jīng)TLC薄層色譜點樣分析顯示有一個主斑點和兩個次要斑點，將組分3再次經(jīng)硅膠柱層析純化，氯仿∶甲醇=100∶6等度洗脫，得到20個組分。經(jīng)TLC點樣分析顯示組分3中的主斑點主要富集于組分3-17中。將組分3-17用LH-20型葡聚糖凝膠柱層析純化，氯仿-甲醇（1∶1）洗脫得到化合物1（62 mg）?；衔?約占代代花全草干重的0.47%。乙酸乙酯萃取液濃縮干燥樣品（42 g）經(jīng)100～200目硅膠柱層析，氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，得到洗脫比例依次為 100∶0、100∶1、100∶4、100∶7、100∶10、90∶10、80∶20、70∶30、50∶50、0∶100 的 10 個組分。組分2（100∶1）反復(fù)經(jīng)葡聚糖凝膠柱層析純甲醇洗脫純化，冷凍干燥后得到白色粉末狀化合物2（16 mg）?；衔?約占代代花全草干重的0.42%。組分5再次經(jīng)硅膠柱層析，氯仿-甲醇系統(tǒng)洗脫純化，將各組分經(jīng)TLC點樣分析顯示組分5-2含有一個主斑點。將組分5-2反復(fù)經(jīng)葡聚糖凝膠柱層析，純甲醇洗脫得到化合物3（65 mg）。化合物3約占代代花全草干重的1.7%。

2.2 三種化合物的抗氧化活性測定

精密稱取三個單體化合物和Vc適量，加以甲醇和蒸餾水使溶解，制成濃度為800 μg/mL的試樣液。采用倍半稀釋法將四種溶液配制成 800 μg/mL、400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL 6個濃度的待測液。采用96孔板法，測定三個化合物和陽性對照品在六個濃度下的Fe3+還原能力和對兩種自由基的清除能力?？傔€原力依照文獻[11]所述方法進行測定；DPPH自由基清除能力按照文獻[12]所述方法進行測定；ABTS自由基清除能力按照文獻[13]所述方法進行測定；鐵離子還原力（FRAP法）參照文獻[14]所述方法進行測定。維生素C作為生物體內(nèi)一種常見的抗氧化劑，其具有很強的還原性，在查閱大量有關(guān)抗氧化能力測定相關(guān)文獻后，本實驗最終采用了維生素C作為四個抗氧化測定體系的陽性對照[15]。

2.3 統(tǒng)計分析方法

抗氧化能力測定實驗均設(shè)置三個平行，所有數(shù)據(jù)均以X±SD表示。采用ANOVA法進行顯著性檢驗，p＜0.05為統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異。

3 結(jié)果與討論

3.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1在冷凍干燥后呈現(xiàn)為白色粉末狀物體，以硅膠薄層層析（氯仿-甲醇=100∶13）展開，呈現(xiàn)單一斑點，在紫外波長254 nm條件下呈淡綠色熒光。1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ∶ 12.97(1H,S,5-OH),10.41(1H,S,4`-OH), 7.07(1H,d,J=1.7,H-2`),6.88(1H,dd,J=8.1,1.7,H-6`),6.77(1H,d,J=8.1,H-5`),5.87(1H,S,H-6),5.87(1H,S,H-8),5.40(1H,dd,J=12.8,2.8,H-2),3.87(3H,s,3,-O CH3),3.22(1H,transm,H-2),2.66(1H,cisdd,J=17.1,2.8,H-2).13C-NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ∶196.3(C-4),166.6(C-7),163.3(C-5),162.8(C-9),147.4(C-3`),146.8(C-4`),12 9.2(C-1`),119.5(C-6`),115.0(C-5`),111.0(C-2`),101.6(C-1 0),94.8(C-6,8),78.6(C-2),55.5(C-OCH3).化合物 1的1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與已報道文獻[16]對比結(jié)果一致，確定其為高圣草素，其結(jié)構(gòu)式如圖 1。其中，不加粗?jǐn)?shù)字代表碳原子化學(xué)位移值大小，加粗?jǐn)?shù)字代表氫原子化學(xué)位移值大小。

圖1 化合物1的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical formula of compound 1

化合物2為白色帶絲光的針狀結(jié)晶，以硅膠薄層層析（氯仿-甲醇=100∶1）展開，呈現(xiàn)單一斑點，在波長356 nm條件下呈深黃綠色熒光。m.p. 186～187 ℃,ESI-MSm/z201 [M-H]-；1H-NMR (DMSO-d6)δ∶8.25(1H, d,J=9.6 Hz, H-4), 7.89 (1H, d, J=2.2 Hz, H-10),7.19(1H, d, J=2.2 Hz, H-9), 7.14 (1H, s, H-8), 6.24 (1H, d,J=9.6 Hz, H-3)；13C-NMR (DMSO-d6)δ∶160.4 (C-2),157.0 (C-7), 152.7 (C-5), 148.0 (C-8a), 144.9(C-10),139.8 (C-4), 112.5 (C-6), 110.9 (C-3), 104.7 (C-9), 103.7(C-4a), 90.9 (C-8).以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[17]對比一致，確定化合物2為佛手酚，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖2。其中，不加粗?jǐn)?shù)字代表碳原子化學(xué)位移值大小，加粗?jǐn)?shù)字代表氫原子化學(xué)位移值大小。

圖2 化合物2的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.2 Chemical formula of compound 2

化合物3為無色針狀結(jié)晶，氯化鐵顯色劑反應(yīng)呈紫色，m.p. 228～230 ℃，在波長356 nm紫外條件下呈紫紅色色熒光。1H-NMR (400 MHz，CD3OD)δ∶7.46(2H,d，J=8.9Hz，H-2’，6’)，7.16 (2H, d, J= 8.9 Hz,H-3′, 5′)，5.92 (1H, s, H-8), 5.91 (1H, d, H-6)，5.44 (1H,dd, J= 12.4, 3.0 Hz, H-2),4.96 (1H, d, J= 7.0 Hz, H-1″),3.13（1H,dd, J=16.8,12.6Hz,H-3a）,2.77 (1H, dd, J=17.4，4. 14 Hz, H-3b),3.40～3.50（m, Glc-H）.13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ∶ 196.8 (C-4), 166.9 (C-7), 163.1 (C-5),163.1 (C-9), 146.9 (C-4′),131.5 (C-1′), 127.3 (C-2′, 6′),114.5 (C-3′,5′), 103.1 (C-10), 95.5(C-6),95.1(C-8),78.2(C-2),42.4(C-3).99.4(C-1′),76.4(C-5′),76.0(C-3′),72.8(C-2′),69.3(C-4′),60.5(C-6′)。

以上1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與已報道文獻[18]對比結(jié)果一致，確定其為南酸棗苷，結(jié)構(gòu)式如圖3所示。其中，不加粗?jǐn)?shù)字代表碳原子化學(xué)位移值大小，加粗?jǐn)?shù)字代表氫原子化學(xué)位移值大小。

圖3 化合物3的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.3 Chemical formula of compound 3

3.2 化合物抗氧化活性

3.2.1 總還原力

三種化合物和陽性對照Vc在不同摩爾濃度下的總還原力如圖4所示。

圖4 不同樣品的總還原力Fig.4 Total reducing power of compound 1, 2, 3 and Vc

由圖4可知，三種化合物和Vc的總還原力均呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系，即總還原力隨著樣品濃度的增大而增強。不同樣品在相同濃度下的總還原力大小各有不同。當(dāng)樣品濃度低于100 μg/mL時，佛手酚的總還原力最強，其次是南酸棗苷和高圣草素，此時三個化合物的總還原力均強于陽性對照Vc。當(dāng)樣品濃度高于100 μg/mL時，Vc的總還原力最強，其次是佛手酚和高圣草素，南酸棗苷最弱。在最高濃度800 μg/mL時，佛手酚的總還原力為1.554，還原能力接近陽性對照的2.0716。三種化合物顯示的較強的還原能力可能與其均含有酚羥基結(jié)構(gòu)有關(guān)，它們能夠?qū)⒊嘌}還原成黃血鹽，然后在與三價鐵離子作用生成普魯士藍，以此體現(xiàn)了三者潛在的抗氧化性能。

3.2.2 清除ABTS自由基

圖5 不同樣品的ABTS自由基清除效果Fig.5 ABTS scavenging effect of compound 1, 2, 3 and Vc

三種化合物和Vc在不同摩爾濃度下對ABTS自由基的清除效果如圖5所示。由圖5可知，三種化合物和Vc對ABTS自由基的清除均呈良好的劑量依賴關(guān)系。在較低濃度下（50 μg/mL），佛手酚、高圣草素和南酸棗苷對ABTS自由基的清除能力依次為40%、45%和22%，三者的清除能力均高于陽性對照的17%。在中等濃度（100～200 μg/mL）時，佛手酚和高圣草素的清除能力最好，其次是Vc，南酸棗苷最弱。在較高濃度（400～800 μg/mL）時，Vc對ABTS自由基的清除能力最強，且在最高濃度800 μg/mL時，佛手酚和高圣草素的清除率分別為100%和95%，二者清除效果接近或等于陽性對照的 100%。三種化合物含有大量的醇羥基和酚羥基，羥基基團提供的質(zhì)子通過對自由基基團的清除體現(xiàn)了其較強的自由基清除能力和抗氧化潛能。

3.2.3 清除DPPH自由基

三種化合物和Vc在不同摩爾濃度下對DPPH自由基的清除效果如圖6所示。由圖6可知，高圣草素對 DPPH自由基的清除率沒有隨著濃度的增大而升高，在實驗設(shè)定最高濃度下的清除率僅為24%。佛手酚和南酸棗苷的自由基清除率隨著樣品濃度的增大而升高，且佛手酚的整體清除效果稍微高于南酸棗苷。在最高濃度800 μg/mL時，佛手酚和南酸棗苷的清除率分別為79%和61%，二者清除效果接近陽性對照的90%。通過與ABTS自由基清除結(jié)果比較可知，高圣草素對自由基的清除能力具有一定的選擇性。相同濃度下（800 μg/mL），其在保持對ABTS自由基較強的清除能力（95%）的同時，對DPPH自由基的清除率僅為24%。

圖6 不同樣品的DPPH自由基清除效果Fig.6 DPPH scavenging effect of compound 1, 2, 3 and Vc

3.2.4 鐵離子還原力

圖7 不同樣品的鐵離子還原能力Fig.7 Fe3+ reducing power of compound 1, 2, 3 and Vc

三種化合物和陽性對照Vc在不同摩爾濃度下對鐵離子的還原能力如圖7所示。由圖7可知，與陽性對照鐵離子還原能力具有明顯的濃度依賴性不同，南酸棗苷的鐵離子還原能力隨著濃度的增大平緩增強，在實驗設(shè)定最高濃度下的 FRAP值僅為陽性對照FRAP值的22.53%。所有樣品的鐵還原能力均呈一定的劑量依賴關(guān)系，其中Vc的還原能力最強，其次是佛手酚和高圣草素，南酸棗苷的還原能力最弱。在最高濃度800 μg/mL時，佛手酚和高圣草素的FRAP值分別為1.5585和1.1239，二者的鐵離子還原能力比較接近于陽性對照的2.1682。通過與上述三種體系的結(jié)果比較可知，南酸棗苷保持對自由基較強清除能力的同時，其鐵離子還原能力較為一般?？赡艿脑驗榛衔锏慕o質(zhì)子能力或清除自由基能力并不能代表其自身的金屬離子螯合能力。

4 結(jié)論

4.1 代代花乙醇提取物經(jīng)過分級萃取分別得到代代花氯仿萃取部位和乙酸乙酯萃取部位，然后經(jīng)過傳統(tǒng)柱層析手段，結(jié)合高效液相色譜技術(shù)從氯仿部位分離得到一個黃酮類化合物高圣草素，從乙酸乙酯部位分離得到一個黃酮類化合物南酸棗苷和一個香豆素類化合物佛手酚，三者均為首次從代代花中分離得到。

4.2 通過四種體外抗氧化能力測定方法，綜合評價了三種化合物的抗氧化活性。實驗結(jié)果表明，三種化合物均具有良好的抗氧化活性，且在不同抗氧化測定指標(biāo)中，三者的還原能力和對自由基的清除能力具有一定的選擇性。佛手酚在四種體系中均表現(xiàn)了很強的抗氧化能力，高圣草素對ABTS自由基的清除能力最強，南酸棗苷則對DPPH自由基的清除能力最為顯著。

4.3 代代花富含黃酮和揮發(fā)油類成分，主要包括橙皮苷、柚皮苷和新橙皮苷等黃酮類物質(zhì)。趙海燕[19]對從代代花中分離得到的三個化合物進行了抗氧化活性研究，結(jié)果顯示三個化合物的總體抗氧化效果較為一般。本文研究表明，代代花中黃酮類化合物和香豆素類化合物具有較強的抗氧化能力。從代代花中分離得到的高圣草素、佛手酚和南酸棗苷在體外抗氧化體系里面表現(xiàn)出的整體抗氧化活性較已報道成分的抗氧化作用更加顯著，具有一定的研究價值和應(yīng)用前景。