野葛根酸性多糖的結(jié)構(gòu)鑒定及免疫活性

董洲，李惠嫻，張猛猛，賴富饒，張曉元，吳暉,

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）（2.韶關(guān)市華工高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)研究院，廣東韶關(guān) 512027）

葛根是豆科葛屬多年生落葉藤本植物的塊根，藥食同源，分為粉葛和野葛。粉葛富含淀粉，是重要的食材及食品添加劑；野葛為中醫(yī)中常用的祛風(fēng)解毒藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有解肌退熱、生津、透疹和升陽止瀉等功效。因富含異黃酮類、多糖類、氨基酸及微量元素等物質(zhì)，素有“南方人參”的美譽(yù)?，F(xiàn)代科學(xué)已證明其具有廣泛的藥理和保健功能，其有效成分在維持心血管系統(tǒng)穩(wěn)定性、保護(hù)腦神經(jīng)、抗氧化、防止肝腎損傷、改善代謝與免疫功能等方面均有一定的藥理作用，葛根黃酮具有改善心腦血液循環(huán)，擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，降血壓，降血糖等作用；大豆苷元有明顯抗心律失常作用，抑制白血細(xì)胞的增殖及黑色素瘤細(xì)胞的分化，具有可觀的臨床應(yīng)用前景[1,2]。

多糖是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一，由多個(gè)單糖分子縮合、失水而成，是一類分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜且龐大的糖類物質(zhì)。分子量從幾萬到幾千萬，具有許多生物活性，包括抗感染、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、降血糖和抗病毒等作用。多糖廣泛存在于高等植物、動(dòng)物細(xì)胞膜、微生物細(xì)胞壁中，不但是生物體的重要組成部分還參與多種生理功能[3～5]。

野葛根多糖是一種天然的高分子聚合物，安全無毒，具有顯著的生物活性和廣泛的藥理作用，是潛在的輔助治療腫瘤藥物以及其它重要保健品的原材料[6～9]。國內(nèi)外針對(duì)葛根的研究主要集中于其中黃酮類物質(zhì)的生物活性，以及葛根多糖的抗氧化性研究，對(duì)于野葛根多糖的免疫活性研究卻鮮有報(bào)道。

本文以野葛根為原料，對(duì)其多糖進(jìn)行分離純化，結(jié)構(gòu)鑒定，免疫活性的研究，為野葛根多糖在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用與開發(fā)奠定扎實(shí)基礎(chǔ)，指明出新的方向。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

野葛根購于廣州清平中藥材市場(chǎng)；碳酸氫鈉、無水乙醇、苯酚、硫酸、氯化鈉、氯仿、正丁醇（均為分析純），廣東光華科技股份有限公司；重水分析純Damas-beta；剛果紅、甲基紅、溴甲酚綠（均為分析純），天津大茂化學(xué)試劑廠；PBS磷酸緩沖液，Gibco公司；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma公司；羊血鴻泉生物；小鼠IL-6 Elisa試劑盒、小鼠TNF-αElisa試劑盒，欣博盛生物科技有限公司；一氧化氮（NO）測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所等。

1.2 儀器與設(shè)備

JC101型不銹鋼鼓風(fēng)干燥箱，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BSZ-16OF自動(dòng)部份收集器，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；SCIENTZ-18N低溫冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；凝膠滲透色譜柱，美國Waters公司；氣相色譜儀，美國惠普公司；傅里葉變換VERTEX33紅外光譜儀，Brucker公司；紫外-可見分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）S-3700N，日本日立公司；HP4890D氣相色譜儀，美國惠普公司；600 MHz核磁共振波譜儀（Nuclear Magnetic Resonance，NMR），Brucker公司等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 野葛根粗多糖的提取

將野葛根用粉碎機(jī)粉碎后過120目篩，過篩后加入80%的乙醇，85 ℃冷凝回流2.5 h進(jìn)行脫脂處理。稱取脫脂后葛根20 g，按料液比1∶30，在99 ℃條件下攪拌浸提2.5 h后，離心（3000 r/min，10 min），取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1/3～1/5體積，以Sevag法除蛋白，離心(3000 r/min，10 min)去除中間有機(jī)相與水相交界處乳化層，合并上清液，加入4倍的無水乙醇沉淀多糖，4 ℃條件下靜置過夜，離心（3000 r/min，10 min）收集沉淀，收集的沉淀物用蒸餾水復(fù)溶，透析48 h后凍干得野葛根粗多糖[10～11]。

1.3.2 野葛根粗多糖的純化

準(zhǔn)確稱取100 mg上述野葛根粗多糖干品充分溶解于10 mL無菌水中，用膠頭滴管將配好的粗多糖溶液全部滴加上樣至 DEAE-Sepharose Fast Flow（3.6 cm×20 cm）纖維素陰離子交換層析柱中，依次用0，0.1，0.2，0.3，0.5 mol/L NaCl溶液洗脫，流速 1 mL/min，每管收集10 mL，苯酚-硫酸法跟蹤顯色定性，將洗脫液分開收集，濃縮，透析，冷凍得到不同野葛根多糖組分；稱取20 mg的干品溶于4 mL超純水后，上樣至Sephacryl S-200 HR凝膠柱（1.6 cm×70 cm）中，蒸餾水洗脫，流速0.4 mL/min，每管5 mL，苯酚-硫酸法跟蹤顯色，洗脫液收集，濃縮、透析、干燥得到較純的野葛根多糖GE-2。

1.3.3 GE-2的分子量及純度測(cè)定[12]

采用高效凝膠滲透色譜法對(duì)GE-2的分子量進(jìn)行測(cè)定。樣品與不同分子質(zhì)量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品用 0.02 mol/L的KH2PO4溶液配制成1.0 mg/mL的溶液，過0.45 μm濾膜，上樣20 μL，檢測(cè)45 min，色譜條件：TSK G-5000PWXL凝膠柱（7.8 nm×300 mm）和TSK G-3000PWXL凝膠柱（7.8×300 mm）串聯(lián)，流動(dòng)相0.02 mol/L的KH2PO4緩沖溶液，pH 6.0，流速0.6 mL/min，柱溫35 ℃，所用檢測(cè)器為2414示差檢測(cè)器。

1.3.4 電子顯微鏡掃描（SEM）[13]

將制得的少量樣品GE-2分散固定在金屬樣品臺(tái)上，清除多余的不能被粘附在樣品臺(tái)上的粉末，使得樣品臺(tái)上保留一層薄薄的待測(cè)樣品。將黏附有樣品的樣品臺(tái)置于鍍膜儀中鍍金后，在掃描電子顯微鏡下放大不同的倍數(shù)來觀察樣品的表面結(jié)構(gòu)。

1.3.5 紫外全波段掃描[14]

稱取一定量的野葛根多糖GE-2，配成濃度為0.05 mg/mL的溶液，用UV2300紫外可見光分光光度計(jì)在190～400 nm下進(jìn)行連續(xù)掃描，掃描間距為0.5 nm，以蒸餾水為空白繪制紫外掃描光譜圖，并對(duì)其進(jìn)行分析。

1.3.6 紅外光譜分析[15]

稱取少量的GE-2樣品(1～5 mg)，與適量的干燥的KBr粉末混和，研磨均勻后壓片。將制好的壓片置于傅里葉變換紅外光譜儀中在 4000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外掃描，對(duì)采集到紅外吸收?qǐng)D譜進(jìn)行分析。

1.3.7 單糖組成測(cè)定[16,17]

1.3.7.1 GE-2水解

稱取10 mg GE-2于安瓿瓶中，加入4 mL 2 mol/L三氟乙酸（TFA），將安瓿瓶封口后置于110 ℃下反應(yīng)6 h。反應(yīng)完后，冷卻至室溫，減壓旋干TFA，加入1 mL甲醇混合后，繼續(xù)蒸干，重復(fù)3次。

1.3.7.2 衍生化反應(yīng)

向GE-2的水解物中加入1 mL吡啶和10 mg鹽酸羥胺，置于90 ℃下恒溫震蕩反應(yīng)30 min反應(yīng)完后冷卻，加入1 mL醋酸酐，于90 ℃下進(jìn)行乙酰化反應(yīng)30 min，最終生產(chǎn)糖腈乙酸酯衍生物，冷卻過有機(jī)膜，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶待測(cè)。所有的單糖標(biāo)準(zhǔn)品和混標(biāo)也按照上述步驟進(jìn)行衍生化并轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中待測(cè)。

1.3.7.3 GC條件

使用Agilent HP-5毛細(xì)管柱(30 m×320 μm×0.25 μm)；載氣為N2，載氣流量為20.0 mL/min，進(jìn)樣量為1.0 μL，分流比為 10∶1。程序升溫：165 ℃后以0.5 ℃/min變速升至171 ℃，再以1 ℃/min速度升溫至180 ℃。

1.3.8 三螺旋結(jié)構(gòu)[20]

5 mg GE-2加入2 mL去離子水和2 mL 80 μmol/L剛果紅試劑，逐漸加入4.0 mol/L NaOH，使溶液中減濃度在0～0.5 mol/L，用400～600 nm進(jìn)行紫外掃描，測(cè)各堿性條件下最大吸收波長。

1.3.9 核磁共振譜分析[21～23]

稱取50 mg左右的GE-2溶于600 μL重水中，震蕩混勻使其完全溶解后轉(zhuǎn)移至核磁管中，于核磁共振儀上進(jìn)行一維1H譜、13C譜測(cè)量分析。

1.3.10 GE-2的免疫調(diào)節(jié)活性研究[24]

1.3.10.1 GE-2溶液的配制

將GE-2用DMEM培養(yǎng)基溶解后配成1 mg/mL的母液，并等梯度稀釋成1000 μg/mL、500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL 和 62.5 μg/mL 五個(gè)劑量組。

1.3.10.2 細(xì)胞培養(yǎng)

解凍小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7，迅速將解凍細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15 mL的無菌離心管，加入12 mL DMEM培養(yǎng)基，混勻后低速離心（1000 r/min，5 min）。除去培養(yǎng)基，加入新鮮的培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸浮后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37 ℃，5% CO2），每隔兩天換一次培養(yǎng)基。

1.3.10.3 GE-2對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌細(xì)胞因子的影響

將處于對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，配成細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，反復(fù)吹打均勻后接種于 96孔板中(100 μL/孔)，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)使細(xì)胞重新貼壁。24 h后，吸去培養(yǎng)基，加入100 μL 不同濃度（1000 μg/mL、500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL 和 62.5 μg/mL）的 GE-2 溶液，陽性對(duì)照組加入100 μL脂多糖（20 μg/mL），空白組加入100 μL DMEM培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)平行孔。將細(xì)胞放回CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用一氧化氮檢測(cè)試劑盒和Elisa試劑盒測(cè)定細(xì)胞上清液中NO和細(xì)胞因子（TNF-α和IL-6）的表達(dá)量。

1.3.11 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次，采用Origin 8和SPSS 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 野葛根多糖離子交換柱層析

圖1 GE在DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱上的洗脫曲線Fig.1 Anion-exchange chromatography (DEAE-Sepharose Fast Flow) of GE

將制得的野葛根粗多糖用 DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析進(jìn)行分離。作為大多數(shù)的中性多糖可被蒸餾水順利洗脫，而被吸附的酸性多糖則可用不同濃度的 NaCl溶液洗脫。經(jīng)過蒸餾水和梯度濃度（0.1，0.2，0.3，0.5 mol/L）的NaCl洗脫后得到不同的吸收峰，如圖1所示，一共出現(xiàn)兩個(gè)峰值大于1.0的峰，分別為蒸餾水以及0.1 mol/L NaCl的洗脫峰，命名為GEa（蒸餾水洗脫組分）、GEb（0.1 mol/L NaCl洗脫組分）以及數(shù)個(gè)峰值小于0.25的雜峰。分別收集兩個(gè)吸收峰對(duì)應(yīng)的收集管中的洗脫液，經(jīng)濃縮-透析-真空冷凍干燥后得到較純的野葛根多糖 GEa和 GEb進(jìn)行下一步研究，GEa為中性多糖，GEb為酸性多糖。得率分別為：12.34%和5.68%。由于關(guān)于野葛根酸性多糖的研究近乎沒有，本文選擇對(duì)酸性多糖GEb進(jìn)行研究。

2.2 GEb的凝膠過濾柱層析

圖2 GEb的Sephacryl S-200 HR凝膠層析洗脫圖Fig.2 Elution profile of GEbOnSephacryl S-200 HR column

將制得的GEb用Sephacryl S-200 HR凝膠柱進(jìn)一步分離純化，如圖2所示，只出現(xiàn)一個(gè)洗脫峰，該吸收峰峰值較高且無雜峰，說明多糖的分離效果較好，純度較高。收集吸收峰相對(duì)應(yīng)的收集管內(nèi)的溶液，進(jìn)一步濃縮、透析、真空冷凍干燥后得到白色絮狀固體，命名為GE-2，經(jīng)苯酚-硫酸法分析得到GE-2的糖含量為98.3%，經(jīng)硫酸-咔唑法測(cè)定GE-2中葡萄糖醛酸含量為21.65%，將GE-2用于后續(xù)的結(jié)構(gòu)鑒定。

2.3 GE-2的分子量及純度測(cè)定

圖3 GE-2的GPC色譜圖Fig.3 Chromatography of GE-2 by GPC

如圖3所示，在33 min前出現(xiàn)樣品的單一洗脫峰；在34 min出現(xiàn)的為溶劑水的洗脫峰。通過軟件計(jì)算得出GE-2數(shù)均分子量Mw為12300 u。比起大部分的植物多糖，GE-2的分子量較小，且該分子量的葛根多糖之前未見報(bào)道，證明GE-2屬于一種新型多糖。

2.4 GE-2的SEM分析

圖4 GE-2的SEM圖Fig.4 SEM images of GE-2

利用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察葛根多糖GE-2的固態(tài)表觀形貌，圖4所示是GE-2放大1000倍的電子顯微鏡掃描結(jié)果，從圖中可觀察到GE-2多糖主要呈條帶狀，表面光滑，分子間存在大量的無規(guī)則交叉結(jié)構(gòu)。局部可觀察到聚集態(tài)乳狀結(jié)構(gòu)，分子的規(guī)整性不強(qiáng)，可初步猜測(cè)該多糖結(jié)構(gòu)中可能存在支鏈，且結(jié)構(gòu)中存在較強(qiáng)的分子間相互作用力[24]。多糖表面均勻，光滑，沒有大面積的褶皺出現(xiàn)。

2.5 紫外全波段掃描

圖5 GE-2的紫外掃描光譜圖Fig.5 Ultraviolet scanning spectra of GE-2

如圖5所示GE-2在260 nm和280 nm附近沒有出現(xiàn)特征吸收峰，表明分離得到GE-2不含多肽、蛋白質(zhì)和核酸，通過Sevage法除蛋白以及經(jīng)離子柱和凝膠柱分離后得到了純度較高的多糖。

2.6 紅外光譜分析

圖6 GE-2的紅外掃描圖Fig.6 FT-IR spectrum of GE-2

紅外光譜法是用來研究不同原子之間和極性鍵間的振動(dòng)，是糖類物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究的一個(gè)重要手段。一般來說，吸收峰出現(xiàn)在3600～3200 cm-1區(qū)域內(nèi)的為分子內(nèi)羥基O-H鍵的伸縮振動(dòng)。C-H鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰出現(xiàn)在 3000～2800 cm-1范圍內(nèi)，1400～1200 cm-1區(qū)出現(xiàn)的較小的吸收峰為C-H的變角振動(dòng)吸收，這兩個(gè)區(qū)域?yàn)榕袛嗵穷惖奶卣餍晕辗?。全譜中最強(qiáng)的吸收峰出現(xiàn)在1200～1000 cm-1區(qū)間，由C-O-H和糖環(huán)C-O-C的兩種C-O鍵伸縮振動(dòng)所引起的。1200～800 cm-1以下為多糖的指紋區(qū)，此區(qū)域可以判斷糖的類型和構(gòu)型。GE-2的紅外吸收光譜如圖6所示。

GE-2在3414 cm-1處出現(xiàn)吸收峰，峰型較寬，是由于糖鏈中非游離 O-H伸縮振動(dòng)引起的。2931 cm-1處的吸收峰是由于C-H反對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起的，這些都證明了GE-2為糖類物質(zhì)。1645 cm-1為多糖結(jié)合水引起的吸收峰值或者為 C=O的伸縮振動(dòng)峰。1417～1245 cm-1范圍出現(xiàn)吸收峰是由于O-H變角振動(dòng)和C-O的伸縮振動(dòng)引起的。圖譜在1245～1022 cm-1的三個(gè)峰值1154 cm-1、1084 cm-1、1028 cm-1是吡喃環(huán)中的伸縮振動(dòng)引起的，表明了GE-2糖鏈中含有吡喃型糖環(huán)。845 cm-1處的吸收峰表明α-葡萄吡喃糖存在。764 cm-1為D-吡喃環(huán)的對(duì)稱環(huán)伸縮振動(dòng)峰。紅外分析表明，該組分多糖亞基可能是由含有中性單糖的單糖殘基組成的聚合體，單糖殘基中存在α-吡喃糖苷。

2.7 單糖組成分析

圖7 單糖標(biāo)準(zhǔn)品（a）和GE-2（b）糖腈乙酸酯的氣相色譜圖Fig.7 Ion exchange chromatography of monosaccharides mixture (a), and GE-2 (b)

圖7a為混標(biāo)的出峰時(shí)間圖，出峰先后順序?yàn)椋菏罄钐?，核糖，阿拉伯糖，木糖，甘露糖，葡萄糖，半乳糖醛酸，果糖，?nèi)標(biāo)出峰時(shí)間為12.377 min。圖7b中出現(xiàn)的兩個(gè)峰分別為葡萄糖以及內(nèi)標(biāo)，且出峰時(shí)間與混標(biāo)相吻合，因此GE-2的單糖組成只含有葡萄糖。王振斌從葛根中提取出三種多糖組分 PS-D1、PS-D2和PS-D3。PS-D1主要含有D-果糖和D-葡萄糖，摩爾比為1∶12.3；PS-D2主要含有D-果糖和D-葡萄糖，摩爾比為1∶11.4；PS-D3主要含有D-果糖、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖和 D-半乳糖，摩爾比為 8.9∶22.3∶1∶1[25]。顯然GE-2的單糖組成不同于PS-D1、PS-D2和PS-D3，這種差異的原因可能是與葛根的的種類、產(chǎn)地以及分離純化方法有關(guān)。GE-2可能為一種新型多糖。

2.8 三螺旋結(jié)構(gòu)

圖8 不同堿濃度下剛果紅與多糖混合液的波長變化Fig.8 Absorption wavelength change of Congoredpolysaccharide complex at different NaOH solutions

剛果紅是一種常被用于驗(yàn)證多糖鏈狀結(jié)構(gòu)的染料，它能與三螺旋構(gòu)象的多糖形成絡(luò)合物，使剛果紅的最大吸收波長發(fā)生偏移，在一定的NaOH濃度范圍內(nèi)，其最大波長的特征為顏色由紅色變成紫紅色，當(dāng)NaOH濃度超過某一數(shù)值后，多糖三螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，其最大吸收波長急劇下降[26～27]。

本實(shí)驗(yàn)采用剛果紅法對(duì)GE-2是否具有三螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定和分析。如圖8所示，GE-2與剛果紅形成其形成絡(luò)合物，與剛果紅相比最大吸收波長并沒有發(fā)生紅移，當(dāng)NaOH濃度的不斷增大，GE-2的最大吸收波長也沒有發(fā)生急劇的下降，可以判斷出GE-2不具有三螺旋結(jié)構(gòu)。

2.9 核磁共振譜分析

核磁共振（NMR）是分析多糖結(jié)構(gòu)最為精確、高效的方法之一。本文中采用一維核磁共振波譜技術(shù)1H譜，13C譜對(duì)葛根多糖GE-2中糖苷鍵類型、單糖殘基的種類和異頭碳等結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析。

從一維碳譜圖中可以看出，異頭碳的共振峰集中在δ60.44～100.13范圍內(nèi)，α-型糖苷異頭碳的化學(xué)位移通常在δ95～101范圍內(nèi)，而多數(shù)β-型糖苷異頭碳的化學(xué)位移位于δ101～105，由圖9b可知GE-2是以α-型糖苷構(gòu)型存在。13C譜在δ103～112以及δ82～84區(qū)間均沒有信號(hào)，表明GE-2不含呋喃糖，從而也可確定單糖殘基為吡喃糖構(gòu)型。δ99.55和100.01處出現(xiàn)的異頭碳信號(hào)分別代表(1→4)和(1→4,6)糖苷鍵，δ60.32為(1→4)糖苷鍵中C→6 的特征峰，δ73.2、71.49、70.94和 76.72處出現(xiàn)的共振峰分別代表(1→4)糖苷鍵中C→3、C→2、C→5 和 C→4。δ76.23、72.7、73.24和 73.38處出現(xiàn)的共振峰代表(1→4,6)糖苷鍵中的C→3、C→2、C→4和C→5。在一維氫譜圖中可以看出，GE-2的1H信號(hào)大多集中在δ3.50～5.50處，δ5.28和 5.12處出現(xiàn)的異頭質(zhì)子信號(hào)代表(1→4)和(1→4,6)糖苷鍵[28,29]。在δ5.00～5.40、5.04、5.07、5.10、5.15，5.19、5.27、5.28和5.32出現(xiàn)信號(hào)峰表明GE-2中存在α-型吡喃糖。這與紅外測(cè)得的結(jié)果相符。δ3.5～4.50為C-2、C-3、C-4和C-5位的氫信號(hào)所在的區(qū)域，此區(qū)域的氫信號(hào)較復(fù)雜地重疊在一起。

圖9 GE-2的核磁共振波譜圖Fig.9 NMRspectrum of GE-2

2.10 GE-2的免疫調(diào)節(jié)活性研究

先天性免疫應(yīng)答的刺激調(diào)節(jié)可以增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗外源病原體的威脅。一般認(rèn)為，免疫系統(tǒng)的刺激調(diào)節(jié)主要是通過激活巨噬細(xì)胞系統(tǒng)和補(bǔ)體系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)的[30～32]。

圖10 GE-2對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7的毒性實(shí)驗(yàn)Fig.10 Effect of GE-2 on the viability of RAW 264.7 cells

圖11 不同濃度的Ge-2對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞表達(dá)NO（a）、TNF-α（b）和IL-6（c）的影響Fig.11 Effects of different concentrations of GE-2 on macrophage (a) NO, (b) TNF-α and (c) IL-6 secretion

本文研究了不同濃度GE-2對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子NO、TNF-α和IL-6的影響。如圖10所示，隨著GE-2濃度的上升，小鼠巨噬細(xì)胞存活率穩(wěn)定在98%左右，且不同濃度下得細(xì)胞存活率間無顯著性差異，說明GE-2的濃度梯度不會(huì)對(duì)小鼠細(xì)胞造成毒害作用。如圖11所示，經(jīng)過GE-2處理后，小鼠巨噬細(xì)胞中NO、TNF-α和IL-6的表達(dá)量均顯著升高，且表達(dá)量隨著GE-2濃度的升高而升高，呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)。圖11a顯示，GE-2對(duì)NO的表達(dá)在濃度250μg/mL到500 μg/mL內(nèi)上升速度放緩，在1000 μg/mL濃度時(shí)NO表達(dá)量最高。圖11b顯示，TNF-α的濃度在GE-2低濃度時(shí)為陰性對(duì)照的2倍左右，GE-2濃度在500 μg/mL 到1000 μg/mL范圍內(nèi)時(shí)，TNF-α濃度上升速度明顯放緩，TNF-α的表達(dá)量無明顯差異；經(jīng)過1000 μg/mL GE-2處理的細(xì)胞其TNF-α的表達(dá)水平為陰性對(duì)照的3倍左右。圖11c顯示，GE-2對(duì)IL-6的激活表達(dá)較為顯著，小鼠巨噬細(xì)胞經(jīng)1000 μg/mL的GE-2處理后其IL-6的表達(dá)水平將近是陰性對(duì)照組的40倍。綜合以上指標(biāo)，表明GE-2具有顯著的免疫調(diào)節(jié)活性。

3 結(jié)論與展望

通過熱水浸提及離子層析分離從野葛根體粗多糖中分離純化得均一酸性多糖 GE-2。GPC測(cè)得其分子量為12300 u。經(jīng)紫外光譜、FT-IR、SEM、GC、NMR、剛果紅分析，結(jié)果顯示，Ge-2的單糖組成為葡萄糖，含有α-（1→4）和α-（1→4,6）糖苷鍵，沒有三螺旋結(jié)構(gòu)，具有無序的空間結(jié)構(gòu)。本文研究不同濃度GE-2對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子NO、TNF-α和IL-6的影響，發(fā)現(xiàn)小鼠巨噬細(xì)胞中NO、TNF-α和IL-6的表達(dá)量隨著GE-2濃度的升高而升高，呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)，說明其有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性。本文的研究結(jié)果為野葛根多糖類產(chǎn)品的開發(fā)和利用提供了一定的科學(xué)證據(jù)和研究思路。