竹節(jié)參總皂苷改善高脂高糖飲食小鼠的神經(jīng)炎癥及可能的機(jī)制

王東帆，王瑞，袁丁，張長(zhǎng)城，劉朝奇，袁成福，周志勇，何毓敏，頓耀艷，王婷

（1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北宜昌 443002）（2.三峽大學(xué)仁和醫(yī)院，湖北宜昌 443001）（3.缺血性心腦疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)宜昌市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（三峽大學(xué)），湖北宜昌 443002）

隨著人類生活水平的不斷提高，人們?nèi)粘Ｊ秤玫氖澄镏泻写罅康奶呛椭镜雀吣芰砍煞郑咧咛秋嬍吃谌藗冿嬍辰Y(jié)構(gòu)中占有的比例成分越來(lái)越大，人們所熟知的是長(zhǎng)期的高脂高糖飲食會(huì)導(dǎo)致肥胖、糖尿病和脂肪肝等代謝綜合征疾病的高發(fā)病率。然而，高能量飲食也會(huì)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生較大的影響。據(jù)報(bào)道，長(zhǎng)期高能量飲食可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變，如產(chǎn)生阿爾茲海默癥，認(rèn)知功能障礙和抑郁癥等神經(jīng)退行性疾?。欢袠猩窠?jīng)系統(tǒng)病變伴隨著神經(jīng)炎癥的發(fā)生[1,2]。大量研究結(jié)果表明，高脂高糖飲食可誘導(dǎo)腦組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生。如高脂高糖飲食可導(dǎo)致小鼠海馬組織結(jié)構(gòu)變化，使錐體細(xì)胞大量變性，并可顯著增加小鼠腦組織中炎性因子表達(dá)[3,4]。

竹節(jié)參(Panax japonicus Rhizoma)是五加科人參屬植物竹節(jié)參(Panax japonicus.C.A.Mey)的干燥呈竹鞭狀根莖，其主要活性成分為竹節(jié)參總皂苷(Saponins of Panax Japonicus，SPJ)?，F(xiàn)代藥理研究表明竹節(jié)參具有良好的抗炎活性[5]，如袁丁等人研究發(fā)現(xiàn)竹節(jié)參總皂苷可顯著對(duì)抗小鼠耳腫脹和大鼠足腫脹模型的炎癥反應(yīng)[6]；竹節(jié)參總皂苷可改善LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)[7]。越來(lái)越多的研究表明竹節(jié)參總皂苷對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用，且對(duì)神經(jīng)炎癥具有良好的抑制作用。Deng等人研究發(fā)現(xiàn)竹節(jié)參總皂苷能夠顯著抑制自然衰老大鼠所致的神經(jīng)炎癥反應(yīng)[8]；另外，竹節(jié)參總皂苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用[9]。但是，竹節(jié)參總皂苷是否對(duì)高脂高糖飲食誘導(dǎo)的腦組織炎癥反應(yīng)有調(diào)節(jié)作用尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以高脂高糖飲食為模型，研究竹節(jié)參總皂苷對(duì)腦組織炎癥反應(yīng)的影響，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 動(dòng)物及飼料

雄性Balb/c小鼠，SPF級(jí)，體重18～22 g，周齡為4～6周。三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)（（SCXK）（鄂）2008-0005）。飼養(yǎng)于室溫20～25 ℃、相對(duì)濕度50%～80%、明暗交替12 h/12 h環(huán)境，自由攝食飲水。高脂高糖飼料：按照53%普通飼料，20%果糖，5%膽固醇，20%豬油，1%食鹽，0.25%膽酸鈉的比例壓制而成，并進(jìn)行輻照滅菌處理。

1.1.2 藥物及試劑

竹節(jié)參購(gòu)于湖北恩施州宣安縣椿木營(yíng)竹節(jié)參種植基地，由湖北省天然產(chǎn)物研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鄒坤教授鑒定。根據(jù)課題組前期研究方法，取干燥竹節(jié)參藥材粗粉，采用醇提法進(jìn)行竹節(jié)參總皂苷的分離和純化[10]。鼠單抗 iNOS（sc-7271），兔單抗ASC(sc-514414)，美國(guó)Santa cruz公司；兔多抗NLRP3（ab214185），兔多抗IL-1β（ab9722），美國(guó)abcam 公司；兔單抗 COX-2（#12282），兔單抗 β-actin（4970L），美國(guó) cell signaling公司；鼠單抗 Caspase-1（NB100-56565），美國(guó)novus公司。山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗，武漢科瑞有限公司。其它所用試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器

Power Pac200 western blotting電泳儀，美國(guó)Bio-Rad；EG1150H石蠟包埋機(jī)、TP1020自動(dòng)脫水機(jī)、EG1150C超薄切片機(jī)，德國(guó)Leica公司；IX53顯微鏡，日本Olympus公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型與給藥

將40只小鼠隨機(jī)分為4組，即正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、竹節(jié)參總皂苷低劑量組（16.7 mg/kg），竹節(jié)參總皂苷高劑量組（50 mg/kg），每組10只。分別給予普通飼料，高脂高糖飼料以及含相應(yīng)劑量竹節(jié)參總皂苷的高脂高糖飼料，持續(xù)喂養(yǎng)4個(gè)月。

1.2.2 小鼠腦皮層組織HE染色

腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉小鼠，胸主動(dòng)脈灌注生理鹽水沖洗血液，然后灌注 4%多聚甲醛，斷頭取腦固定于4%多聚甲醛。脫水后，石蠟包埋組織，4 μm切片進(jìn)行HE染色，鏡下觀察皮層部位神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.3 Western Blot檢測(cè)小鼠腦皮層組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)

檢測(cè)NLRP3炎癥小體、ASC、Caspase-1、iNOS和COX-2蛋白的表達(dá)。提取小鼠腦皮層組織總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，加入Loading buffer后95 ℃變性10 min。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗4 ℃過(guò)夜。加入二抗室溫孵育1 h，洗膜，ECL顯影。

1.2.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠腦皮層組織中IL-1β和Iba-1蛋白的表達(dá)

小鼠腦組織切片常規(guī)脫蠟至水，高壓抗原修復(fù)，3%H2O2室溫10 min封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS沖洗，5%BSA室溫封閉1 h，甩去多余液體，加一抗4 ℃過(guò)夜。PBS沖洗，二抗室溫孵育1 h，PBS沖洗，鏡下觀察DAB顯色。蒸餾水洗片，蘇木素復(fù)染，脫水透明封片，鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

Western Blot條帶應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行灰度掃描分析，以樣品各蛋白的灰度值與其內(nèi)參β-actin的比值代表蛋白相對(duì)表達(dá)量。免疫組化用Image Pro Plus軟件進(jìn)行IOD掃描，用SPSS 18.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，各組均數(shù)用單因素方差分析，p＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 竹節(jié)參總皂苷對(duì)高脂高糖飲食小鼠腦組織形態(tài)學(xué)的影響

腦組織皮層HE染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組皮層神經(jīng)細(xì)胞胞核清晰，僅有少量變性細(xì)胞。模型對(duì)照組皮層神經(jīng)細(xì)胞排列散亂，且出現(xiàn)大量變性，細(xì)胞核固縮為三角形或不規(guī)則形狀且呈深伊紅色。給予竹節(jié)參總皂苷干預(yù)4個(gè)月后可明顯改善神經(jīng)細(xì)胞病理變化，結(jié)果如圖1所示。

圖1 竹節(jié)參總皂苷對(duì)高脂高糖飲食小鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的影響（×400）Fig.1 Effect of SPJ on the morphology of cortical neurons in HFFD mice (×400)

2.2 竹節(jié)參總皂苷對(duì)高脂高糖飲食小鼠腦皮層組織中小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)關(guān)鍵的免疫細(xì)胞，是對(duì)神經(jīng)炎癥免疫應(yīng)答的主要神經(jīng)細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食能夠引起小鼠腦組織海馬齒狀回區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化及其數(shù)量的增多[11]，Iba-1抗體可特異性標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞。本研究通過(guò)免疫組化染色標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞，同樣也發(fā)現(xiàn)高脂高糖飼料喂養(yǎng)的模型對(duì)照組小鼠腦皮層組織中小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較正常對(duì)照組明顯增多，經(jīng)竹節(jié)參總皂苷的干預(yù)后，小鼠腦皮層中小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著減少。結(jié)果如圖2所示。

圖2 竹節(jié)參總皂苷對(duì)高脂高糖飲食小鼠皮層組織中小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響（×400）Fig.2 Effect of SPJ on the activation of microglia in the cortex of HFFD mice (×400)

2.3 竹節(jié)參總皂苷對(duì)高脂高糖飲食小鼠皮層組織中炎性因子COX-2和iNOS蛋白表達(dá)影響

環(huán)氧合酶 2(cyclooxygenase，COX-2)是合成前列腺素過(guò)程中一個(gè)重要的誘導(dǎo)型限速酶，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)，其在正常狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)的活性極低，當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)會(huì)在神經(jīng)元中呈現(xiàn)高表達(dá)水平。生理狀態(tài)下，由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)僅有少量表達(dá)，炎癥發(fā)生時(shí)其活性增強(qiáng)并催化釋放大量的 NO，產(chǎn)生神經(jīng)毒性。這兩種酶與炎癥反應(yīng)有密切關(guān)系。Western blot結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠腦皮層組織中COX-2和iNOS蛋白表達(dá)水平顯著升高（p＜0.01或 p＜0.05），竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后可顯著減少 COX-2和 iNOS的蛋白表達(dá)水平（p＜0.05或p＜0.01），結(jié)果如圖3所示。

圖3 竹節(jié)參總皂苷對(duì)高脂高糖飲食小鼠皮層組織中炎性因子COX2和iNOS蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of SPJ on the expression of COX2 and iNOS in the cortex of HFFD mice

2.4 竹節(jié)參總皂苷對(duì)高脂高糖飲食小鼠皮層組織中NLRP3炎癥小體相關(guān)因子表達(dá)的影響

NLRP3炎癥小體是由模式識(shí)別蛋白NLRP3，接頭蛋白即凋亡相關(guān)點(diǎn)狀蛋白（ASC）和效應(yīng)分子半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）組成，活化的 Caspase-1能進(jìn)一步促進(jìn)IL-1β的成熟與分泌，誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)[12]。NLRP3炎癥小體參與多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生與發(fā)展，與神經(jīng)炎癥反應(yīng)關(guān)系密切。

Western blot結(jié)果所顯示，與正常的對(duì)照組相比，模型的對(duì)照組皮層的組織中 NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)的水平均顯著地升高（p＜0.05）；竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后可顯著減少 NLRP3、ASC、Caspase-1的蛋白表達(dá)的水平（p＜0.05或p＜0.01），其結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 竹節(jié)參總皂苷對(duì)高脂高糖飲食小鼠NLRP3炎癥小體相關(guān)因子表達(dá)的影響Fig.4 Effect of SPJ on the expression of NLRP3 inflammasome in HFFD mice

圖5 竹節(jié)參總皂苷對(duì)高脂高糖飲食小鼠皮層組織中IL-1β表達(dá)的影響（×400）Fig.5 Effect of SPJ on the expression of IL-1β in the cortex ofHFFD mice (×400)

IL-1β免疫組化染色結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠皮層組織 IL-1β表達(dá)顯著升高（p＜0.01）；竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后可顯著減少 IL-1β的表達(dá)水平（p＜0.01或p＜0.001），結(jié)果如圖5所示。

3 討論

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)關(guān)鍵的免疫細(xì)胞，是對(duì)神經(jīng)炎癥免疫應(yīng)答的主要神經(jīng)細(xì)胞。高脂高糖飲食可引起小膠質(zhì)細(xì)胞活化并釋放炎性因子引起神經(jīng)炎癥反應(yīng)[13,14]。T Kaur研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食使青年雌性大鼠海馬和皮層組織中小膠質(zhì)細(xì)胞顯著增多，且顯著上調(diào)iNOS、COX-2、IL-1β等炎性因子的蛋白表達(dá)水平[15]。J Yang等人研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食8周小鼠下丘腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba-1以及炎性因子IL-1β的蛋白表達(dá)水平顯著升高，且高脂條件下培養(yǎng)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中iNOS、IL-1β的mRNA水平顯著升高[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂高糖飲食四個(gè)月后小鼠皮層組織中變性細(xì)胞增多，小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加，且炎性因子iNOS和COX-2的蛋白表達(dá)水平顯著增多；給予竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后可顯著改善小鼠腦皮層組織病理變化，減少小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，并減少炎癥相關(guān)因子iNOS和COX-2的蛋白表達(dá)，這提示竹節(jié)參總皂苷能減輕高脂高糖飲食誘導(dǎo)的小鼠腦組織炎癥反應(yīng)。

大量研究表明，NLRP3炎癥小體參與阿爾茲海默癥、帕金森病等多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展[17,18]。有研究發(fā)現(xiàn) BV2小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥模型中炎性因子IL-1β的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)NLRP3炎癥小體蛋白表達(dá)量顯著升高，給予 NLRP3炎癥小體抑制劑后，可顯著抑制BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的活化并減輕LPS所致的炎癥反應(yīng)[19]。JL Sobesky[20]研究發(fā)現(xiàn)短期高脂飲食可激活大鼠海馬組織中的小膠質(zhì)細(xì)胞，且 NLRP3炎癥小體蛋白表達(dá)水平、IL-1β的mRNA水平顯著升高。鄧麗麗等[21]人研究發(fā)現(xiàn)竹節(jié)參總皂苷可顯著下調(diào)自然衰老大鼠腦組織中NLRP3炎癥小體及炎性因子IL-1β的蛋白表達(dá)水平，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，竹節(jié)參總皂苷能減輕高脂高糖飲食誘導(dǎo)的小鼠腦組織炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)竹節(jié)參總皂苷可顯著抑制NLRP3炎癥小體、ACS、Caspase-1的蛋白表達(dá)，說(shuō)明竹節(jié)參總皂苷可通過(guò)抑制 NLRP3炎癥小體及其下游炎性因子的表達(dá)而抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)。

4 結(jié)論

長(zhǎng)期高脂高糖飲食使機(jī)體處于慢性炎癥狀態(tài)，我們的研究發(fā)現(xiàn)高脂高糖飲食可引起小鼠腦組織神經(jīng)炎癥反應(yīng)，使皮層椎體細(xì)胞大量變性，小膠質(zhì)細(xì)胞活化，炎性因子表達(dá)水平顯著升高；經(jīng)竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后，高脂高糖飼養(yǎng)的小鼠腦組織炎癥反應(yīng)明顯減輕，且NLRP3炎癥小體及其下游炎性因子IL-1β的表達(dá)水平顯著降低。因此我們得出結(jié)論：竹節(jié)參總皂苷可減輕高脂高糖飲食小鼠腦組織的炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與抑制 NLRP3炎癥小體的活化從而減少炎癥相關(guān)因子的釋放有關(guān)。本研究為高脂高糖飲食導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)的防治提供了新的思路。