茉莉酸甲酯對(duì)丹參毛狀根有效成分含量的影響

熊丙全 劉冬青 廖相建 鄭雪蓮

（1. 成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院園林園藝分院，成都 611130；2. 電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610054）

丹參（Salvia miltiorrhiza），別名紫丹參、血參、大紅袍、紅根等，來(lái)源于唇形科鼠尾草屬植物，以根入藥，其干燥根及根莖，是著名的活血化淤藥，也是大宗藥材之一［1］。目前，丹參野生資源不斷減少，栽培丹參逐漸成為市場(chǎng)供應(yīng)的主要來(lái)源，而栽培丹參存在生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、質(zhì)量不可控、農(nóng)藥殘留等問(wèn)題，尋找一種替代資源尤為重要。利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)丹參生成毛狀根的方法早在20世紀(jì)90年代就已建立，并且獲得了穩(wěn)定的丹參毛狀根株系，且在毛狀根中及培養(yǎng)基中都相繼發(fā)現(xiàn)了丹參酮類、丹酚酸類化學(xué)成分［2-3］，且丹參毛狀根具有生長(zhǎng)迅速、無(wú)激素依賴性、生長(zhǎng)周期短等優(yōu)點(diǎn)，是優(yōu)良的丹參替代材料。但目前丹參毛狀根在規(guī)?；a(chǎn)上還存在毛狀根質(zhì)量不穩(wěn)定、有效次生代謝產(chǎn)物含量低等問(wèn)題，制約其工業(yè)化應(yīng)用。研究者發(fā)現(xiàn)促進(jìn)毛狀根生長(zhǎng)及提高其有效成分的方法有很多，如基因克隆、改變培養(yǎng)基成分及其濃度、添加誘導(dǎo)子、前提物質(zhì)、金屬離子及選擇生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等［4］，其中誘導(dǎo)子的利用可能是解決這一問(wèn)題的較好途徑之一。有研究發(fā)現(xiàn)，茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MJ）作為生物誘導(dǎo)子的一種，在植物次生代謝過(guò)程中起誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，能有效刺激植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成，能誘導(dǎo)包括萜類、黃酮類、生物堿類等化合物的積累［5］。本實(shí)驗(yàn)以茉莉酸甲酯作為丹參毛狀根的誘導(dǎo)子，研究茉莉酸甲酯對(duì)丹參毛狀根中次生代謝產(chǎn)物含量的影響，確定茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)作用，為丹參毛狀根培養(yǎng)的生產(chǎn)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

丹參（Salvia miltiorrhiza）材料分別采集于四川中江、山東等地，由電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院植物基因組工程實(shí)驗(yàn)室根據(jù)不同產(chǎn)地來(lái)源培育成不同品系的無(wú)菌苗。選用Ds5品系。攜帶Ri質(zhì)粒的卸甲根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株C58C1（pRiA4）由上海師范大學(xué)開(kāi)國(guó)銀教授惠贈(zèng)，保存于電子科技大學(xué)植物基因組工程實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 丹參毛狀根的誘導(dǎo)培養(yǎng) 丹參毛狀根采用葉盤法，用根癌農(nóng)桿菌C58C1感染丹參無(wú)菌苗獲得，誘導(dǎo)培養(yǎng)15-20 d，切取長(zhǎng)度1-2 cm生長(zhǎng)良好的毛狀根接入篩選培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為B5+500 mg/L Cef+篩選壓（50 mg/L Kan），置于25℃黑暗條件連續(xù)培養(yǎng)，每10 d繼代1次，繼代1-2次，培養(yǎng)20-30 d［6］。

切取丹參根系材料上長(zhǎng)度約5 cm、旺盛生長(zhǎng)的側(cè)根及主根，測(cè)定鮮重后轉(zhuǎn)入液體發(fā)酵培養(yǎng)基（1/2 B5+500 mg/L Cef）中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，每瓶放入3-5根，26℃，120 r/min，黑暗培養(yǎng)18 d；在丹參毛狀根液體培養(yǎng)基中加入濃度為200 μmol/L的MJ進(jìn)行誘導(dǎo)處理，設(shè)置3次重復(fù)，未添加MJ為對(duì)照，觀察毛狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)第5、10和15天的生長(zhǎng)情況，分別取樣測(cè)定誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d和15 d的毛狀根鮮重；培養(yǎng)15 d后，取樣測(cè)定毛狀根的干重，水溶性酚酸類化合物（迷迭香酸、丹酚酸B）和脂溶性丹參酮類化合物（丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA）的含量。

1.2.2 茉莉酸甲酯用量及溶液配制 茉莉酸甲酯（MJ）以無(wú)水乙醇為助溶劑，配制成50%的母液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜除菌，加入培養(yǎng)基中，使MJ終濃度為 200 μmol/L［7］。

1.2.3 丹參毛狀根樣品制備 將誘導(dǎo)培養(yǎng)一定時(shí)間的丹參毛狀根從培養(yǎng)基中取出，自來(lái)水沖去培養(yǎng)基，吸水紙吸干，40℃烘箱烘干至恒重，室溫冷卻，稱取干重，干燥后的毛狀根作為有效成分含量測(cè)定的材料，回流1 h得到樣品，測(cè)定其HPLC含量。

1.2.4 丹參毛狀根有效成分含量測(cè)定 將10 mg/mL的丹參毛狀根甲醇提取液用于HPLC檢測(cè)［8］。檢測(cè)條件為：色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，SP-120-5-C18-AP，4.6 mmID×250 mm；流動(dòng)相A：0.2%磷酸水溶液；流動(dòng)相B：乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；流速：0.7 mL/min；柱溫：35℃；梯度洗脫條件：0-5 min：10%乙腈；5-10 min：10%乙腈-20%乙腈；10-15 min：20%乙腈-25%乙腈；15-40 min：25%乙腈-60%乙腈；40-60 min：60%乙腈；60-70 min：60%乙腈-100%乙腈；70-80 min：100%乙腈。色譜圖如圖1所示。

圖1 丹參毛狀根丹酚酸類成分以及丹參酮類成分的色譜圖

2 結(jié)果

2.1 茉莉酸甲酯誘導(dǎo)條件下丹參毛狀根表型變化

分別觀察茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的丹參毛狀根（MJ+）和未被茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的丹參毛狀根（MJ-）在誘導(dǎo)培養(yǎng)5、10和15 d后的生長(zhǎng)量及液體培養(yǎng)情況。結(jié)果（圖2和表1）表明，隨培養(yǎng)時(shí)間增加，丹參毛狀根分支數(shù)量逐漸增加：從誘導(dǎo)培養(yǎng)第5天起，隨培養(yǎng)時(shí)間增加，相較對(duì)照（MJ-），MJ+處理?xiàng)l件下丹參毛狀根生長(zhǎng)量逐漸增加，誘導(dǎo)培養(yǎng)15 d時(shí)丹參毛狀根鮮重顯著高于對(duì)照，且毛狀根表皮色澤顯著加深。以上結(jié)果表明，MJ+處理?xiàng)l件下，可以促進(jìn)丹參毛狀根生長(zhǎng)，并可調(diào)控丹參毛狀根次生代謝產(chǎn)物合成、積累，從而可能影響丹參毛狀根次生代謝產(chǎn)物組分、含量改變，因此，進(jìn)一步測(cè)定MJ+處理?xiàng)l件下丹參毛狀根中主要次生代謝產(chǎn)物含量。

圖2 MJ+處理?xiàng)l件下丹參毛狀根生長(zhǎng)表型對(duì)比變化結(jié)果

表1 MJ+處理?xiàng)l件下丹參毛狀根鮮重統(tǒng)計(jì)（x-±s，n=3）

2.2 茉莉酸甲酯對(duì)毛狀根中丹參酮類成分含量的影響

分別測(cè)定MJ-、MJ+培養(yǎng)15 d丹參毛狀根中2種脂溶性丹參酮類化合物（丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA）含量（圖3）。通過(guò)茉莉酸甲酯的處理，丹參毛狀根中丹參酮Ⅰ的含量達(dá)0.0523 mg/g，是對(duì)照的1.53倍；丹參毛狀根中丹參酮ⅡA的含量達(dá)到0.1062 mg/g，是對(duì)照的1.16倍。由結(jié)果可見(jiàn)，茉莉酸甲酯誘導(dǎo)毛狀根，能有效地提高丹參毛狀根中丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的含量。

圖3 茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的丹參毛狀根中丹參酮類成分的含量變化（x-±s，n=3）

2.3 茉莉酸甲酯對(duì)毛狀根中酚酸類成分含量的影響

分別測(cè)定MJ-、MJ+培養(yǎng)15 d的丹參毛狀根中2種水溶性酚酸類化合物（迷迭香酸、丹酚酸B）的含量（圖4）。通過(guò)茉莉酸甲酯處理，丹參毛狀根中迷迭香酸的含量達(dá)51.724 mg/g，是對(duì)照的1.37倍；丹參毛狀根中丹酚酸B的含量達(dá)到52.054 mg/g，是對(duì)照的4.43倍。結(jié)果表明，茉莉酸甲酯誘導(dǎo)毛狀根，可顯著提高其迷迭香酸和丹酚酸B的含量。

圖4 茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的丹參毛狀根中酚酸類成分的含量變化（±s，n=3）

3 討論

已有研究表明，誘導(dǎo)子對(duì)丹參毛狀根次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)效率及積累量有影響［9］。茉莉酸甲酯作為植物次生代謝過(guò)程中起誘導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)作用的物質(zhì)，也是毛狀根培養(yǎng)的生物誘導(dǎo)子之一，有研究者發(fā)現(xiàn)利用茉莉酸甲酯作為誘導(dǎo)子，可有效提高曼陀羅、顛茄等物種毛狀根中次生代謝產(chǎn)物的積累和釋放［5，10］；王學(xué)勇等［7］通過(guò)實(shí)驗(yàn)也證明了茉莉酸甲酯能有效提高丹參酮類成分在丹參毛狀根中的積累并刺激其向培養(yǎng)基中釋放，但尚未有試驗(yàn)證明茉莉酸甲酯對(duì)丹參毛狀根中酚酸類化合物的積累是否有正效應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)比茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的丹參毛狀根（MJ+）和未被茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的丹參毛狀根（MJ-）中酚酸類化合物及丹參酮類化合物的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的丹參毛狀根的丹參酮類化合物丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA分別是MJ-的1.53倍和1.16倍，酚酸類化合物迷迭香酸和丹酚酸B分別是MJ-的1.37倍和4.43倍，其中丹酚酸B的效果尤為顯著，達(dá)到了4.43倍，由此進(jìn)一步證實(shí)了茉莉酸甲酯能有效提高丹參毛狀根中丹參酮類成分的積累，并首次證明酚酸類成分的合成和積累也有顯著提高，說(shuō)明通過(guò)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)可以實(shí)現(xiàn)丹參有效次生代謝產(chǎn)物的高效生產(chǎn)，為丹參毛狀根的工業(yè)化應(yīng)用提供了試驗(yàn)依據(jù)。由丹參毛狀根生長(zhǎng)情況可看出，隨培養(yǎng)時(shí)間增加，次生代謝產(chǎn)物的含量逐漸增加，在確定茉莉酸甲酯對(duì)丹參毛狀根中有效成分含量積累的正效應(yīng)后，其誘導(dǎo)培養(yǎng)的最佳時(shí)間則需要進(jìn)一步探索。

4 結(jié)論

茉莉酸甲酯能有效提高丹參毛狀根中丹參酮類成分的積累，可顯著提高酚酸類成分的合成和積累，通過(guò)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)丹參有效次生代謝產(chǎn)物的高效生產(chǎn)。