棉鈴蟲類肌鈣蛋白多克隆抗體的制備與鑒定

尼加提·迪里木拉提 趙潔 艾新宇 劉小寧

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046）

類肌鈣蛋白（Calponin，Cal），又稱鈣調(diào)寧蛋白。該蛋白于1994年被Applegate 等［1］首次從雞砂囊平滑肌組織中提取并純化出來。隨后發(fā)現(xiàn)其在多種生物體中存在，并在生物體的多個組織中表達(dá)，如人的血管、胃、膀胱、輸尿管、輸精管和子宮等組織平滑肌中都提取并純化出了相關(guān)Calponin蛋白［2］。哺乳動物和鳥類體內(nèi)的Calponin有3種亞型，根據(jù)等電點和同源染色體的不同分為：堿性Calponin（H1-Calponin，PI 8-10），中性 Calponin（H2-Calponin，PI 7-8）和酸性 Calponin（H3-Calponin，PI 5-6）［3］。在哺乳動物體內(nèi)，這3個亞型的1-273位氨基酸有高度的保守性（＞ 70%），氨基端都包含單個CH結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域參與肌動蛋白結(jié)合［4］。羧基端有3個串聯(lián)重復(fù)，但是酸性Calponin的羧基端序列與其他兩者較為不同［3-6］。

Calponin是一種多功能的調(diào)節(jié)蛋白，它調(diào)節(jié)30多種酶的活性［7］。在平滑肌細(xì)胞中Calponin特異性的表達(dá)，其與肌動蛋白/原肌球蛋白細(xì)絲結(jié)合并抑制肌球蛋白 Mg2+-ATPase活性［8-9］。Calponin既通過調(diào)節(jié)肌動蛋白之間的相互作用來調(diào)節(jié)肌肉組織收縮功能，又可以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)激酶或鈣信號的收縮調(diào)節(jié)［10-12］。Calponin被磷酸化能可逆地阻斷其與Ca2+/鈣調(diào)蛋白的相互作用。Calponin也在其他非肌肉細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，如在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中有相關(guān)報道［13］。該蛋白在非肌肉細(xì)胞中調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的生長并增強(qiáng)細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性［13-14］，從而參與細(xì)胞的分裂、運動［15］及免疫調(diào)控［16］等過程。

Koz?owska等［17-18］克隆表達(dá)了果蠅和赤擬谷盜的Calponin家族基因DmChd64和TcChd64，并對這兩個蛋白的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，且有研究證明Chd64與FK506結(jié)合蛋白（FKBP39）有相互作用［17］。HaCal可能參與了棉鈴蟲的變態(tài)過程，結(jié)果顯示HaCal在棉鈴蟲蛹中上調(diào)表達(dá)，而20-羥基蛻皮激素提高了該基因的表達(dá)［19］。棉鈴蟲蛻皮過程中有30種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，包括酶類，調(diào)節(jié)劑，蛋白質(zhì)水解酶和受體蛋白［20］。HaCal與蜜蜂Chd64和果蠅Chd64分別有70%和67%的同源性［21］，因此HaCal可能與某些差異表達(dá)的蛋白存在相互作用。因?qū)aCal的結(jié)構(gòu)特征了解不完全，以及缺少相應(yīng)的抗體，阻礙了人們對HaCal在棉鈴蟲蛻皮和蛹變等發(fā)育過程中的功能認(rèn)識。

本課題組通過酵母單雜交技術(shù)篩選棉鈴蟲CYP6B6基因響應(yīng)2-十三烷酮誘導(dǎo)的調(diào)控因子，從中捕獲到HaCal，且前期已克隆分析了HaCal基因，并在核酸水平上檢測了該基因在棉鈴蟲不同發(fā)育時期和不同組織中的含量，說明HaCal在棉鈴蟲的不同發(fā)育時期和應(yīng)對2-十三烷酮中均發(fā)揮作用。因此本實驗通過純化獲得高濃度融合蛋白His-HaCal，繼而用蛋白免疫法制備了高滴度的棉鈴蟲HaCal多克隆抗體，并驗證了該抗體能與棉鈴蟲體內(nèi)的HaCal特異性結(jié)合，這為后期進(jìn)行HaCal功能的研究，以及與其他蛋白互作的鑒定提供重要的檢測工具。

1 材料與方法

1.1 材料

棉鈴蟲和黃粉蟲由本實驗室飼養(yǎng)，室內(nèi)飼養(yǎng)條件為：溫度25℃，相對濕度為75%，光周期為16 L:8 D。昆明白鼠從新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)院購買。蛋白Marker 和BCA試劑盒購自Thermo Fisher Scientific 公司。小鼠抗His-tag的多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體和DAB顯色試劑盒購自中杉金橋公司（北京）。ELISA板由廣州潔特生物過濾制品有限公司提供，其余所用的化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 HaCal蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化 融合蛋白His-HaCal的大量表達(dá)及純化按照本課題組前期的方法進(jìn)行，并使用Ni-NTA柱純化融合蛋白，對目標(biāo)蛋白的純化采用不同濃度咪唑（0.02 mol/L，2 次、0.04、0.1、0.2及0.5 mol/L）進(jìn)行洗脫，分別收集流出的洗脫液并經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，用BCA蛋白濃度定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。

1.2.2 多克隆抗體的制備 純化后的His-HaCal融合蛋白免疫小白鼠，用此法制備鼠抗His-HaCal的多克隆抗體。第一次免疫前用眼眶采血法收集小白鼠血液，將其37℃放置30 min，4℃放置1 h，5000 r/min離心10 min收集上層清液，將血清放于-80℃保存，作陰性對照。免疫時，每只小鼠用50 μg純化的融合蛋白與等體積的弗氏完全佐劑充分混勻并乳化，足墊和皮下兩部位注射免疫小鼠。兩周一次加強(qiáng)免疫，共4次免疫。除第一次免疫用弗氏完全佐劑以外，其余3次均用弗氏不完全佐劑。免疫4次后收集血清將其放于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 ELISA法檢測鼠抗His-HaCal抗血清效價 抗體滴度的檢測用間接酶聯(lián)免疫吸附測定法（間接ELISA）。His-HaCal抗原經(jīng)包被液稀釋，抗原終濃度10 μg/mL，每孔加入200 μL該包被液包被ELISA板，4℃過夜包被后棄去包被液；用PBST洗滌3次，每孔加入200 μL封閉液（5%脫脂奶粉的PBST），37℃封閉2 h；棄去封閉液后加入100 μL按比例稀釋的抗血清（血清：封閉液），37℃孵育1 h；用PBST洗滌3次，每孔加入100 μL的二抗稀釋液（羊抗鼠IgG：封閉液為1∶3000）；PBST洗滌3次，加入100 μL/孔的TMB顯色液，37℃顯色10 min，最后加入50 μL的H2SO4（2 mol/L）終止反應(yīng)。讀取在450 nm處的OD值。

1.2.4 多克隆抗體的特異性分析 采用TCA/丙酮沉淀法提取棉鈴蟲和黃粉蟲總蛋白，具體步驟參考Li等［22］的方法。將His-HaCal、棉鈴蟲和黃粉蟲總蛋白，SDS-PAGE電泳分離后電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上。用封閉液（5%脫脂奶粉的PBST）37℃封閉1 h，棄封閉液，加入1∶1000稀釋的His-HaCal多克隆抗體37℃孵育1.5 h再用PBST溶液洗膜3次。1∶3000稀釋的二抗（山羊抗鼠IgG抗體），在37℃孵育1.5 h，PBST洗3次后加入DAB底物顯色液避光顯色10 min，顯現(xiàn)清晰條帶后加去離子水終止反應(yīng)并拍照。

免疫組化昆蟲為2齡棉鈴蟲，固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟和抗原的修復(fù)等步驟參考Zhao等［23］的方法，隨后用含有5%脫脂奶粉的PBS進(jìn)行抗原封閉，37℃孵育2 h；洗去封閉液后滴加一抗（血清∶封閉液=1∶1500），4℃過夜孵育，37℃保溫30 min；甩去一抗，用PBS洗滌3次，滴加二抗（山羊抗鼠 IgG∶封閉液=1∶2000），37℃孵育2 h；棄去二抗，用PBS洗滌3次，將組織切片上滴加DAB顯色劑，顯色3 min，蒸餾水沖洗DAB顯色液；隨后進(jìn)行梯度脫水和封片；最后用Nikon NISElements D顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照。

2 結(jié)果

2.1 His-HaCal融合蛋白的表達(dá)純化

先用鎳柱吸附原核表達(dá)的融合蛋白His-HaCal，再用不同濃度的咪唑梯度洗脫，所得的洗脫樣經(jīng)15%的SDS-PAGE電泳檢測（圖1）顯示His-HaCal在0.02、0.04、0.1、0.2和0.5 mol/ L咪唑濃度的洗脫液都能洗下來，其中0.5 mol/ L咪唑濃度的洗脫液能洗脫比較單一的融合蛋白His-HaCal，可以用于后期的免疫小鼠制備抗體。

圖1 融合蛋白在不同濃度的咪唑洗脫液純化洗脫

2.2 融合蛋白的Western blot鑒定

Western blot鑒定原核表達(dá)的融合蛋白His-HaCal，結(jié)果（圖2）表明雜交出的條帶大小與預(yù)計大小23.9 kD相符合，說明融合蛋白表達(dá)正確。

圖2 純化后的融合蛋白His-HaCal Western blot鑒定

2.3 ELISA檢測鼠抗His-HaCal多克隆抗體效價

用His-HaCal融合蛋白4次免疫小白鼠后，ELISA方法測定抗血清效價。從圖3可以看出當(dāng)血清稀釋819200倍時，樣品在450 nm的光吸收值大于陰性對照數(shù)值的2.1倍，即抗血清效價均大于819200，甚至部分樣品（2號老鼠）抗血清效價達(dá)到1638400，說明已達(dá)到預(yù)期的實驗要求。

2.4 His-HaCal多克隆抗體免疫特異性檢測

圖3 ELISA測定His-HaCal多克隆抗體效價

用已制備好的抗His-HaCal多克隆抗體檢測棉鈴蟲和黃粉蟲的總蛋白，Western blot結(jié)果（圖4-A）顯示所制備的多克隆抗體與棉鈴蟲天然HaCal蛋白特異性結(jié)合，條帶大?。?0.52 kD）正確，而與黃粉蟲的總蛋白無雜交條帶。用免疫后的小鼠血清對棉鈴蟲中腸組織進(jìn)行免疫組化分析（圖4-B），表明該血清能和棉鈴蟲中腸組織天然的HaCal特異性結(jié)合，說明制備的His-HaCal多克隆抗體具有較好的免疫特異性，可以用于后續(xù)的研究。

圖 4 抗HaCal多克隆抗體的免疫特異性檢測

3 討論

類肌鈣蛋白（Calponin）是一種肌動蛋白結(jié)合蛋白，有抑制肌動球蛋白Mg2+ATPase的活性［8-9］。目前Calponin功能的研究主要涉及協(xié)調(diào)平滑肌的收縮、細(xì)胞增殖及細(xì)胞信號傳導(dǎo)等。Calponin在細(xì)胞信號傳導(dǎo)的過程中，與受體蛋白結(jié)合從而將蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）和絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK） 定 位于細(xì)胞膜上，又能結(jié)合PKC的調(diào)控域從而調(diào)節(jié)PKC的活性。Calponin也能影響該途徑下游基因的轉(zhuǎn)錄激活和表達(dá)，因而改變細(xì)胞增殖［24］。

研究表明Calponin特異性抗體可以作為腫瘤檢測和蛋白檢測的有效工具。Calponin在人類平滑肌組織中的研究較多，可用于臨床診斷［25］。Lee等［26］用免疫組化方法證實Calponin也存在于腎肌成纖維細(xì)胞中，PECs（壁層上皮細(xì)胞）細(xì)胞與含有Calponin的成肌細(xì)胞之間的相互作用能在腎小球硬化晚期診斷中起著關(guān)鍵作用。Calponin2單克隆抗體可用于乳腺癌的早期診斷，此外，Calponin2還有助于判定腫瘤是否為惡性［27］。Meyer-Rochow 等［28］用特異性識別戈爾迪烏斯線蟲Calponin和Troponin（肌鈣蛋白）的兩種抗體來對線蟲體壁肌肉進(jìn)行免疫組化檢測，證實此肌肉具有平滑肌和橫紋肌特征。此特征前期僅在秀麗線蟲中和少數(shù)蛻皮昆蟲中得到證實。

棉鈴蟲的生長和發(fā)育主要由保幼激素（Juvenile hormome，JH）和20-羥基蛻皮激素（20E）控制，JH調(diào)控幼蟲狀態(tài)的維持，20E調(diào)控幼蟲的蛻皮和和蛹的變態(tài)，在幼蟲階段結(jié)束時，JH滴度下降至最低水平，20E滴度升高從而開始蛹的變態(tài)過程［29］。棉鈴蟲類肌鈣蛋白（HaCal）屬于Calponin家族蛋白，在棉鈴蟲的整個發(fā)育過程中均表達(dá)，且可能參與幼蟲的蛻皮過程和蛹的變態(tài)過程。Liu等［30］研究發(fā)現(xiàn)，含有Chd結(jié)構(gòu)域的HaCal蛋白在棉鈴蟲蛻皮和蛹變過程中上調(diào)表達(dá)，并被PKC磷酸化，且受20E和鉀氨普烯的誘導(dǎo)表達(dá)量上升，20E誘導(dǎo)后蛋白被磷酸化，而鉀氨普烯誘導(dǎo)后蛋白仍未被磷酸化。HaCal存在于細(xì)胞質(zhì)中，激素誘導(dǎo)后可快速轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，非磷酸化的HaCal能與USP1（泛素特異性蛋白酶）相互作用，在20E的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中作為中間調(diào)節(jié)劑起著關(guān)鍵作用。Burgstaller等［31］的研究表明Calponin的C末端可變區(qū)決定不同類型Calponin的細(xì)胞種類分布和同一類型Calponin的不同功能。Gimona等［32］從雞的骨骼肌肉、腎臟、肝臟和脾臟等組織中提取總蛋白，用抗Calponin蛋白的抗體進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示未檢測到Calponin蛋白，隨后其他研究小組研究亦有相似結(jié)果。

為了得到高效價和高特異性的多克隆抗體，必須對抗原的準(zhǔn)備、實驗動物的選擇、免疫的方式和加強(qiáng)免疫的間隔等方面進(jìn)行詳細(xì)設(shè)計。本實驗選用了蛋白免疫法，此方法比核酸免疫所得到的抗體效價高，但缺點是抗原持續(xù)發(fā)揮作用的時間比核酸免疫持續(xù)的時間短，因此每兩周加強(qiáng)免疫一次［33］。本實驗純化出高純度的His-HaCaL融合蛋白，滿足了抗原免疫要求。選用6周齡且較溫順的雌性小鼠，注射時添加弗氏佐劑來改善免疫反應(yīng)，因為它無免疫原性，且能增強(qiáng)抗原的免疫應(yīng)答過程［34］。本實驗采用足墊加腹部皮下多點注射的方法，因為足墊和腹部皮下的抗原遞呈細(xì)胞較多，有利于對抗原的攝取和加工。前3次免疫用足墊免疫為主皮下免疫為輔，3次免疫后觀察到小鼠足趾腫脹，第四次免疫時選擇皮下免疫為主，足墊免疫輔，且每次總注入量不變。徐霞等（Xu）［35］采用此方法獲得了效價較好的小鼠抗青霉素結(jié)合蛋白（PBP2a）的多克隆抗體，研究顯示不同方法獲得的抗體效價也不同，抗體效價高到低依次為足墊加皮下免疫、腹腔免疫和足墊免疫。本實驗用純化的HaCaL蛋白獲得了滴度高于1∶819200的多克隆抗體，其中二號樣本滴度高達(dá)1∶1638400，表明該抗體可滿足后續(xù)實驗要求。Western blot結(jié)果顯示獲得的抗體能與棉鈴蟲體內(nèi)天然HaCaL蛋白結(jié)合且不能識別黃粉蟲體內(nèi)Calponin蛋白，表明該多克隆抗體的特異性較高。從蛋白水平上對棉鈴蟲類肌鈣蛋白進(jìn)行檢測，相對于核酸水平上檢測，蛋白質(zhì)的功能較穩(wěn)定，從蛋白水平來分析、鑒定更加直接、準(zhǔn)確。隨后通過免疫組化的方法進(jìn)一步證明該蛋白存在于棉鈴蟲的中腸組織中且表達(dá)量較高。

4 結(jié)論

本實驗純化獲得了高濃度的融合蛋白His-HaCal，通過蛋白免疫法制備了高滴度和特異性較高的棉鈴蟲HaCal多克隆抗體，并驗證了該抗體能與棉鈴蟲體內(nèi)的HaCal特異性結(jié)合，這為后期進(jìn)行HaCal功能的研究和與其他蛋白互作的鑒定提供重要的檢測工具。