轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)玉米HGK60的農(nóng)藝性狀分析

梁海生 李夢(mèng)桃 李圣彥 汪海 張杰 郎志宏

（1. 西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，綿陽(yáng) 621010；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081；3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；4. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

玉米是我國(guó)三大農(nóng)作物之一，種植面積和產(chǎn)量居三大作物之首［1］。2016年玉米播種面積為3.677×107hm2，年產(chǎn)量約為2.2億噸。我國(guó)雖然能實(shí)現(xiàn)主糧的基本自給，但農(nóng)產(chǎn)品缺口較大，2013年玉米籽粒進(jìn)口326.42萬(wàn)噸，2014年玉米籽粒進(jìn)口259.90萬(wàn)噸。病蟲(chóng)害是造成玉米減產(chǎn)的重要因素之一，玉米每年受螟蟲(chóng)危害的面積超過(guò)2.335×107hm2，約占種植總面積的70%，2013年造成減產(chǎn)639萬(wàn)噸、2014年造成減產(chǎn)544.78萬(wàn)噸。害蟲(chóng)危害不僅直接造成減產(chǎn)，還常引發(fā)玉米穗腐病，進(jìn)而使籽粒中真菌毒素含量增高，品質(zhì)下降［2］。因此，迫切需要安全有效的措施控制蟲(chóng)害，減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)投入，增加農(nóng)民收入。

傳統(tǒng)防治蟲(chóng)害是在生長(zhǎng)過(guò)程中噴施化學(xué)殺蟲(chóng)劑和生物防治。但前者不僅能殺死害蟲(chóng)，也能殺死害蟲(chóng)的天敵，農(nóng)藥殘留問(wèn)題還會(huì)造成部分農(nóng)民中毒傷亡，害蟲(chóng)的耐藥性增加，也導(dǎo)致農(nóng)藥用量增加，破壞生態(tài)平衡、污染環(huán)境；后者釋放赤眼蜂等方法受氣候條件影響較大，防治效果不理想［3］。而將外源抗蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)入玉米中為培育抗蟲(chóng)玉米新品種提供了新的思路。1995年瑞士先正達(dá)公司通過(guò)基因槍法將來(lái)源于蘇云金芽胞桿菌的cry1Ab轉(zhuǎn)入玉米中獲得的BT176轉(zhuǎn)化事件，以bar作為篩選標(biāo)記，這是世界第一例商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米。1996年美國(guó)孟山都公司將改良后的cry1Ab基因利用基因槍法轉(zhuǎn)入玉米中，獲得抗玉米螟的MON810轉(zhuǎn)基因玉米［4］。在轉(zhuǎn)基因作物應(yīng)用的20多年間，全球農(nóng)藥使用量大幅減少，為可持續(xù)發(fā)展作出了重要貢獻(xiàn)，1996-2015年，節(jié)約了6.2 億kg的農(nóng)藥用量，同比減少8.1%，使環(huán)境影響商數(shù)（EIQ）降低了19%。同時(shí)轉(zhuǎn)基因作物的種植為全球糧食產(chǎn)量帶來(lái)大幅增長(zhǎng)，1996-2015年，作物產(chǎn)量增加5.74億t，產(chǎn)值增加1678億美元［5］。而在歐洲玉米螟（European Corn Borer，ECB）危害嚴(yán)重的情況下，轉(zhuǎn)Bt基因的雜交玉米品種比非轉(zhuǎn)基因雜交品種增產(chǎn)12%-23%［6］；在自然ECB發(fā)生情況下，轉(zhuǎn)Bt基因雜交種比非轉(zhuǎn)基因雜交種增產(chǎn) 5.5%［7］。Elisa等［8］通過(guò)分析 21年的同行文獻(xiàn)得出轉(zhuǎn)基因玉米雜交種的玉米產(chǎn)量比其近等基因系要高5.6%-24.5%。Wang等［9］對(duì)比了轉(zhuǎn)基因雜交玉米12-5×IE034和2個(gè)親本轉(zhuǎn)基因玉米以及

6個(gè)常規(guī)玉米品種中的轉(zhuǎn)錄譜和代謝譜的差異，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因玉米育種基因疊加所帶來(lái)的基因表達(dá)和代謝物的變化數(shù)量介于常規(guī)玉米品種間的變異范圍之內(nèi)。到目前為止，市場(chǎng)中的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米品種全部為國(guó)外公司所擁有。近年來(lái)，我國(guó)雖然在轉(zhuǎn)基因工作中取得重大進(jìn)展，但尚未有一例商業(yè)化抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米品種上市。本研究使用的cry1Ah是從國(guó)內(nèi)篩選的BT8菌株中鑒定克隆的新型Bt基因，具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)［10］，其編碼的殺蟲(chóng)蛋白的殺蟲(chóng)活性?xún)?yōu)于目前使用的cry1Ab和cry1Ac［11］。前期的研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)Bt cry1Ah玉米在溫室和田間具有良好的抗蟲(chóng)效果，證明cry1Ah可作為培育商業(yè)化抗蟲(chóng)玉米的候選基因［12-13］。標(biāo)記基因選用2 m G2-epsps，該基因來(lái)源于熒光假單胞菌G2，編碼5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS），具有草甘膦耐受性［14］。為了獲得滿(mǎn)足商業(yè)化需求的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米品種，前期通過(guò)大規(guī)模遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行群體篩選，獲得一個(gè)Bt蛋白表達(dá)量高且對(duì)亞洲玉米螟有顯著抗性的轉(zhuǎn)化事件HGK60［15］。本研究對(duì)HGK60及其雜交種進(jìn)行了兩地連續(xù)三代的分子檢測(cè)及農(nóng)藝性狀分析，證明HGK60轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米中外源基因能夠穩(wěn)定的遺傳和表達(dá)，對(duì)亞洲玉米螟具有很好的抗性，農(nóng)藝性狀與對(duì)照材料相比無(wú)顯著差異。這將推動(dòng)HGK60轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 玉米自交系鄭58（輪回親本）、轉(zhuǎn)Bt cry1Ah基因抗蟲(chóng)玉米材料HGK60的BC5F2（與鄭58回交5代，自交2代，下同，2016年海南）、BC6F2（2017年廊坊）、BC7F2（2017年海南）及HGK60的BC5F2（2016年海南）、BC6F2（2017年廊坊）、BC7F2（2017年海南）分別與昌7-2的雜交種鄭單958H，雜交種鄭單958，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所郎志宏課題組保存。

1.1.2 供試蟲(chóng)源 亞洲玉米螟由北京美延農(nóng)業(yè)科技有限公司購(gòu)買(mǎi)。

1.2 方法

1.2.1 PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株 取長(zhǎng)至3葉期的玉米幼苗葉片采用CTAB法提取基因組DNA，選用cry1Ah特異性引物和篩選標(biāo)記基因2mG2-epsps特異性引物對(duì)其進(jìn)行PCR檢測(cè)，留存陽(yáng)性植株。cry1Ah特異性引物序列為F1：5'-ATGGGCAAGAACTCCATCAA-3'和 R1：5'-TCAGTCGATGTGGTAGTCGGTAAC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為2007 bp。反應(yīng)條件為94℃5 min ；95℃ 20 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，32 個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。2mG2-epsps特異性引物序列為 F2：5'-ATGGCGTGCCTCCCTGACGA-3'和 R2：5'-TCATCAGTCGTTGAGGTGAA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1338 bp，反應(yīng)條件與上述一致。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株 為了比較不同生長(zhǎng)發(fā)育階段陽(yáng)性植株在轉(zhuǎn)錄水平的差異，對(duì)PCR陽(yáng)性植株進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative RT-PCR）檢測(cè)。取玉米不同生長(zhǎng)時(shí)期（抽穗期、灌漿期）的展開(kāi)葉、雄穗、穗軸、花絲、苞葉和籽粒組織，提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo公司，美國(guó)）合成cDNA，采用SYBR GreenⅠ定量PCR試劑盒（Roche公司，瑞士）。反應(yīng)體系為2×FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）10 μL、上游引物（10 μmol/L）0.4 μL、下游引物（10 μmol/L）0.4 μL、cDNA 模板 2 μL，加水補(bǔ)至 20 μL。反應(yīng)條件為 95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 60 s（采集熒光信號(hào)），共40個(gè)循環(huán)。將SYBR GreenⅠ的擴(kuò)增產(chǎn)物從60℃緩慢而均勻地以0.3℃/s的速率升溫到95℃，記錄熒光信號(hào)的變化，繪制出擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線。內(nèi)參基因?yàn)橛衩變?nèi)參actin，引物 為 F3：5'-CGAATGCCCAGCAATGTA-3'和 R3：5'-TTAGGTGGTCGGTGAGGT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為188 bp。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因玉米Cry1Ah蛋白表達(dá)含量分析 取玉米不同生長(zhǎng)時(shí)期（六葉期、大喇叭口期、抽穗期、灌漿期）的心葉、展開(kāi)葉、莖、雄穗、花絲、穗軸、苞葉、根和籽粒組織，提取可溶性總蛋白，利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）轉(zhuǎn)基因植株的Cry1Ah蛋白表達(dá)量，以純化的Cry1Ah蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白提取及ELISA檢測(cè)方法均按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Envirologix公司。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因玉米高代自交系和雜交組合的主要農(nóng)藝性狀考察 2016年12月-2018年3月，對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米進(jìn)行了兩地連續(xù)三代田間試驗(yàn)，地點(diǎn)為河北省中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)際農(nóng)業(yè)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園生物技術(shù)示范基地和海南省中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院南繁基地。試驗(yàn)地分小區(qū)種植，設(shè)3次重復(fù)，重復(fù)內(nèi)各材料隨機(jī)排列。按照鄭58、HGK60、鄭單958及鄭單958H分4個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)種植10 行，行長(zhǎng)5 m，行寬0.60 m，每行種植20株。試驗(yàn)地不進(jìn)行任何蟲(chóng)害的治理，其他（如水、肥以及除草等）完全與常規(guī)大田管理一樣。生長(zhǎng)期間調(diào)查出苗期、吐絲期等生育期。在每個(gè)品種內(nèi)隨機(jī)選取100株，吐絲后測(cè)量株高、穗位高，收獲后考種，于室內(nèi)測(cè)量穗長(zhǎng)、穗粗、禿尖長(zhǎng)、穗行數(shù)、行粒數(shù)等農(nóng)藝指標(biāo)，果穗干燥后脫粒稱(chēng)重，并求千粒重。

1.2.5 玉米種子發(fā)芽率檢測(cè) 對(duì)收獲的玉米種子進(jìn)行發(fā)芽率檢測(cè)，按GB/T 3543.3規(guī)定的方法進(jìn)行。采用紙床紙間發(fā)芽方法，先將玉米種子表面消毒（2%的次氯酸鈉溶液浸泡10 min），然后將濾紙放在培養(yǎng)皿內(nèi)，用水將濾紙濕潤(rùn)，將消毒后的種子均勻放置在濕潤(rùn)的濾紙上，再用另一張同樣大小的濾紙覆蓋在種子上，蓋上培養(yǎng)皿，放入25℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)。每個(gè)培養(yǎng)皿擺放13粒種子，每個(gè)品種3皿為一組（統(tǒng)計(jì)單位），重復(fù)3次，每個(gè)品種共計(jì)9皿，117粒種子。發(fā)芽過(guò)程中，逐日統(tǒng)計(jì)正常發(fā)芽種子的粒數(shù)，4 d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，7 d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。

1.2.6 玉米螟室內(nèi)外生測(cè)

1.2.6.1 玉米螟田間生測(cè) 按照農(nóng)業(yè)部953號(hào)公告-10-2007在大田進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。對(duì)小喇叭口期的鄭58、HGK60、鄭單958及鄭單958H，以每株40-60頭玉米螟初孵幼蟲(chóng)的用量接于心葉中，3 d后重復(fù)接蟲(chóng)一次，吐絲期除接蟲(chóng)部位為玉米花絲外其他同上。在接蟲(chóng)14-21 d后，按照公告標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行等級(jí)判定。

1.2.6.2 玉米螟室內(nèi)生測(cè) 按照宋苗等［15］方法，采集生長(zhǎng)至小喇叭口期玉米心葉，用細(xì)毛筆輕輕將亞洲玉米螟初孵幼蟲(chóng)接入放有玉米心葉的24 孔生測(cè)皿中，每24 h調(diào)查幼蟲(chóng)存活數(shù)，每個(gè)試驗(yàn)材料重復(fù)3次。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 利用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對(duì)不同處理間平均數(shù)的差異顯著性比較均采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因玉米外源基因cry1Ah和標(biāo)記基因2mG2-epsps的PCR檢測(cè)

對(duì)每一代的轉(zhuǎn)Bt cry1Ah抗蟲(chóng)玉米材料HGK60自交系中的cry1Ah和2mG2-epsps進(jìn)行PCR檢測(cè)，留取陽(yáng)性植株與昌7-2雜交，收獲的鄭單958H種子種植至六葉期，取葉片檢測(cè)陽(yáng)性率。以cry1Ah和2mG2-epsps特異性引物分別檢測(cè)目的基因和標(biāo)記基因，以表達(dá)載體為模板作為陽(yáng)性對(duì)照，以鄭58玉米基因組DNA為模板作為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，含目的基因cry1Ah的轉(zhuǎn)基因HGK60和鄭單958H擴(kuò)增片段為2007 bp，與陽(yáng)性對(duì)照片段大小一致，陰性對(duì)照鄭58未擴(kuò)增出目的條帶，2017廊坊樣品HGK60均有陽(yáng)性條帶，鄭單958H也都有陽(yáng)性條帶（圖1）；圖2顯示，含目的基因2mG2-epsps的轉(zhuǎn)基因HGK60擴(kuò)增出片段為1338 bp，與陽(yáng)性對(duì)照片段大小一致，陰性對(duì)照鄭58未擴(kuò)增出目的條帶，2017海南樣品HGK60均有陽(yáng)性條帶，與昌7-2的雜交種均有陽(yáng)性條帶。初步判斷轉(zhuǎn)Bt cry1Ah抗蟲(chóng)玉米中cry1Ah和2mG2-epsps均能穩(wěn)定遺傳給子代個(gè)體。

圖1 以cry1Ah為引物擴(kuò)增部分2017廊坊HGK60和鄭單958H材料PCR電泳圖

圖2 以2mG2-epsps為引物擴(kuò)增部分2017海南HGK60和鄭單958H材料PCR電泳圖

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

分別取2017年海南生長(zhǎng)至抽雄期、灌漿期的HGK60陽(yáng)性植株及其雜交種鄭單958H各組織進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)（圖3），以灌漿期HGK60籽粒中的cry1Ah轉(zhuǎn)錄水平為參照，HGK60和鄭單958H均為灌漿期的展開(kāi)葉（穗上葉）中cry1Ah轉(zhuǎn)錄水平最高，而穗軸和籽粒的轉(zhuǎn)錄水平較低；抽穗期鄭單958H中cry1Ah轉(zhuǎn)錄水平最高的部位是雄穗，而HGK60中的轉(zhuǎn)錄水平最高部位為展開(kāi)葉。將灌漿期與抽穗期相同組織中cry1Ah轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，HGK60的展開(kāi)葉與苞葉在這兩個(gè)時(shí)期中cry1Ah轉(zhuǎn)錄水平差異顯著；而鄭單958H僅有展開(kāi)葉中cry1Ah轉(zhuǎn)錄水平差異顯著。

圖32017海南HGK60與鄭單958H不同時(shí)期不同組織cry1Ah的轉(zhuǎn)錄水平

2.3 ELISA檢測(cè)Cry1Ah表達(dá)量結(jié)果

利用ELISA方法檢測(cè)兩地連續(xù)三代HGK60及其雜交種不同時(shí)期不同部位的Cry1Ah蛋白表達(dá)量。結(jié)果（圖4）顯示，在2016年海南、2017年廊坊、2017年海南HGK60及其雜交種同一生長(zhǎng)期同一部位的Cry1Ah蛋白表達(dá)量趨于穩(wěn)定，不同生長(zhǎng)期不同部位的Cry1Ah蛋白表達(dá)量存在差異。在抽穗期葉片中Cry1Ah蛋白表達(dá)比六葉期增加30.71%，在灌漿期雄穗中Cry1Ah蛋白表達(dá)量最高，為4017 ng/g（鮮重，下同）。在灌漿期中苞葉及花絲的Cry1Ah蛋白表達(dá)量比抽雄期分別增加41.62%和77.05%。灌漿期籽粒所含Cry1Ah蛋白表達(dá)量為1467 ng/g。表1所示，2017海南HGK60抽穗期中雄穗Cry1Ah表達(dá)量最高，為5720 ng/g，灌漿期中籽粒和穗軸表達(dá)量分別為2630和1106 ng/g；雜交種鄭單958H與自交種HGK60都是在抽穗期雄穗表達(dá)量處于最高水平，而穗軸表達(dá)量在灌漿期顯示下降的趨勢(shì)。雜交種的Cry1Ah表達(dá)量要比自交種HGK60低。

ELISA與實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果相比較，在抽穗期HGK60的雄穗Cry1Ah蛋白表達(dá)量最高，而抽穗期的展開(kāi)葉的轉(zhuǎn)錄水平最高，其雜交種中的cry1Ah雄穗轉(zhuǎn)錄水平最高。這種差異可能與環(huán)境差異有關(guān)，Miluse Trtikova通過(guò)比較2種的轉(zhuǎn)MON810品種發(fā)現(xiàn)由于遺傳背景和環(huán)境差異能造成轉(zhuǎn)基因表達(dá)量和Bt蛋白含量的顯著差異［16］。而苞葉和花絲中的蛋白表達(dá)水平和轉(zhuǎn)錄水平均偏低。灌漿期中展開(kāi)葉的Bt蛋白表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄水平均比抽穗期要高，自交系和雜交種均如此，而籽粒中的蛋白表達(dá)水平和轉(zhuǎn)錄水平均偏低。

圖42017廊坊HGK60不同時(shí)期不同組織Cry1Ah蛋白表達(dá)

表12017海南部分HGK60和鄭單958H不同時(shí)期不同組織Cry1Ah蛋白表達(dá)

2.4 轉(zhuǎn)基因玉米高代自交雜交系的主要農(nóng)藝性狀結(jié)果

2.4.1 轉(zhuǎn)基因?qū)τ衩咨诘挠绊?從表2可以看出，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米鄭單958H與鄭單958在同一世代出苗期一致，抽雄期、吐絲期及生育期略有差異，但只有1-2 d，差異不大。播種到抽雄時(shí)間2017年海南、2017年廊坊和2016年海南分別為47、65-66和42-43 d。生育期各代分別是95、125-126和92-93 d。各世代從播種到抽雄時(shí)間以及生育期不同，這主要是因?yàn)楹颖崩确患昂Ｄ先齺喸诓煌瑫r(shí)期的有效積溫及土壤類(lèi)型不同造成的。轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米HGK60與鄭58亦如此。

從3個(gè)世代的物候期調(diào)查結(jié)果可以得出轉(zhuǎn)入Bt cry1Ah對(duì)玉米生育期的影響不大。

2.4.2 轉(zhuǎn)基因?qū)τ衩字旮?、穗部及產(chǎn)量性狀的影響 對(duì)2個(gè)世代的轉(zhuǎn)cry1Ah抗蟲(chóng)玉米的農(nóng)藝性狀進(jìn)行了田間跟蹤調(diào)查及實(shí)驗(yàn)室考種工作。由表3可知，鄭單958H與鄭單958在不接玉米螟時(shí)，在同一世代株高、穗位高、穗長(zhǎng)、穗粗、穗行數(shù)、禿尖長(zhǎng)、行粒數(shù)、千粒重雖有差異，但差異不大，經(jīng)檢驗(yàn)差異不顯著；但鄭單958H的產(chǎn)量與鄭單958的差異比較大，除了2017廊坊的產(chǎn)量差異不顯著，在2017廊坊和2017海南鄭單958H比鄭單958分別增產(chǎn)7.91%和9.1%。在小喇叭口期和吐絲期接玉米螟后，鄭單958H與鄭單958同一世代穗長(zhǎng)、穗行數(shù)、禿尖長(zhǎng)、行粒數(shù)、千粒重雖有差異，但差異不大，經(jīng)檢驗(yàn)差異不顯著；但鄭單958H的株高在2個(gè)世代比鄭單958均差異較大，達(dá)極顯著水平；在2017海南鄭單958H的產(chǎn)量比鄭單958增產(chǎn)10.15%，經(jīng)檢驗(yàn)差異顯著。

不同世代間同一性狀的差異主要是由于試驗(yàn)地點(diǎn)的土壤氣候條件不同造成的，總體趨勢(shì)為，在海南種植的植株株高和穗位高度比在廊坊種植的低，接蟲(chóng)后的產(chǎn)量要比不接蟲(chóng)的產(chǎn)量低，接蟲(chóng)后的轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)量要比非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)量要高，且差異顯著。隨著育種代數(shù)的增高，田間單株間已經(jīng)變化不大，即各群體的農(nóng)藝性狀隨著世代的增加更加趨于穩(wěn)定。為轉(zhuǎn)Bt基因玉米自交系能夠直接用于育種提供了有力證據(jù)。

表2 不同年份不同材料的物候期

表3 不同年份的鄭單958H和鄭單958農(nóng)藝性狀

2.5 轉(zhuǎn)基因?qū)τ衩追N子發(fā)芽率的影響

由圖5及表4可以得出，轉(zhuǎn)基因玉米鄭單958H與非轉(zhuǎn)基因玉米鄭單958進(jìn)行比較，在發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)上存在一定的差異，經(jīng)t檢驗(yàn)，進(jìn)行差異顯著性分析，P值分別為0.3302、0.2174和0.3958均大于0.05，因此差異不顯著。轉(zhuǎn)基因玉米HGK60與非轉(zhuǎn)基因玉米鄭58也在發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)上存在一定的差異，經(jīng)t檢驗(yàn)，進(jìn)行差異顯著性分析，P值分別為0.3143、0.4293和0.3518均大于0.05，因此差異不顯著。說(shuō)明轉(zhuǎn)基因玉米鄭單958H與非轉(zhuǎn)基因玉米鄭單958及HGK60與鄭58在發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)上沒(méi)有顯著差異，外源基因Bt cry1Ah的導(dǎo)入對(duì)玉米發(fā)芽活力方面沒(méi)有影響。

圖5 種子發(fā)芽4 d試驗(yàn)

表4 玉米種子發(fā)芽率

2.6 玉米螟室內(nèi)和室外生物活性檢測(cè)結(jié)果

2.6.1 玉米螟室內(nèi)生測(cè) 室內(nèi)接蟲(chóng)3 d后（圖6），轉(zhuǎn)基因玉米中玉米螟幼蟲(chóng)全部死亡，葉片鮮嫩，基本無(wú)危害，且蟲(chóng)孔只有針孔大小。第7天時(shí)陰性對(duì)照鄭58活蟲(chóng)個(gè)體較大，有較強(qiáng)的爬行活力，葉片受玉米螟危害較嚴(yán)重，有較多蟲(chóng)孔。室內(nèi)接蟲(chóng)3 d后，咬食HGK60和鄭單958H死亡率如表5所示，取食轉(zhuǎn)基因玉米心葉的玉米螟幼蟲(chóng)死亡率顯著高于陰性對(duì)照，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異極顯著（P＜0.01），表明轉(zhuǎn)Bt cry1Ah玉米材料HGK60和鄭單958H對(duì)玉米螟幼蟲(chóng)有顯著殺蟲(chóng)效果，該結(jié)果與宋苗等［15］結(jié)果一致。

表5 取食HGK60及鄭單958H葉片的亞洲玉米螟幼蟲(chóng)死亡率/%

圖6 取食HGK60葉片的亞洲玉米螟室內(nèi)生測(cè)

2.6.2 玉米螟田間生物活性檢測(cè) 由圖7可知，轉(zhuǎn)基因玉米的葉片在接蟲(chóng)兩周后基本無(wú)玉米螟危害，只有少量針孔大小的蟲(chóng)孔，而陰性對(duì)照葉片受害嚴(yán)重，有多個(gè)超過(guò)火柴頭大小的蟲(chóng)孔。按照判定標(biāo)準(zhǔn)，HGK60田間抗性等級(jí)是1.27±0.61級(jí)，為高抗級(jí)別，相同處理的陰性對(duì)照平均抗性等級(jí)為6.59±1.43級(jí)，為感蟲(chóng)級(jí)別。玉米吐絲期將玉米螟幼蟲(chóng)接于玉米花絲，HGK60和鄭單958H玉米的雄穗和雌穗受害微小，按照判定標(biāo)準(zhǔn)抗性級(jí)別為1.74±0.52級(jí)，屬高抗級(jí)別，而陰性對(duì)照的雄穗和雌穗受害較嚴(yán)重，抗性級(jí)別為7.58±1.95級(jí)，屬感蟲(chóng)級(jí)別。證明HGK60及其雜交種對(duì)玉米螟有很強(qiáng)的抗性，此結(jié)果與室內(nèi)抗蟲(chóng)性鑒定結(jié)果一致。田間生測(cè)結(jié)果同時(shí)也與宋苗等［15］生測(cè)結(jié)果一致，證明該材料具有良好的田間抗蟲(chóng)穩(wěn)定性。室內(nèi)和田間蟲(chóng)測(cè)結(jié)果與熒光定量PCR、ELISA結(jié)果一致。

圖7 轉(zhuǎn)基因玉米的田間生測(cè)

3 討論

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的轉(zhuǎn)基因植株，整合到植物基因組中的外源基因一般遵循孟德?tīng)栠z傳分離規(guī)律并能夠穩(wěn)定遺傳和表達(dá)［17］。Paz等［18］將已經(jīng)商業(yè)化17年的3種MON810轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行Southern雜交，在插入序列和側(cè)翼序列均未發(fā)現(xiàn)序列重排，進(jìn)一步分析28個(gè)不同的MON810品種基因組側(cè)翼序列中存在的點(diǎn)突變和插入缺失，得出轉(zhuǎn)入的基因突變率與玉米內(nèi)源基因的突變率相同的結(jié)論。兩地連續(xù)三代種植轉(zhuǎn)基因玉米HGK60及其雜交種鄭單958H經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示能穩(wěn)定遺傳與表達(dá)Bt cry1Ah基因。新表達(dá)蛋白Cry1Ah表達(dá)量在同一生長(zhǎng)期同一部位趨于穩(wěn)定，不同生長(zhǎng)期不同部位存在差異。研究發(fā)現(xiàn)雄穗中Cry1Ah表達(dá)量在玉米抽穗期和灌漿期均居于最高水平，葉片的表達(dá)量次之，而苞葉和花絲的蛋白表達(dá)量在灌漿期增高。玉米螟在抽穗期取食幼嫩的雄穗，雄穗中高表達(dá)的Bt蛋白能有效防治玉米螟的危害。玉米螟在灌漿期咬食花絲、苞葉和籽粒，苞葉和花絲的表達(dá)量提升能減少授粉期間玉米螟對(duì)苞葉和花絲的危害。田間生測(cè)HGK60和鄭單958H雄穗沒(méi)有出現(xiàn)折斷及被咬食的情況，而大部分鄭58和鄭單958的雄穗在玉米吐絲期被咬食嚴(yán)重甚至被折斷。HGK60和鄭單958H的苞葉、花絲和籽粒玉米螟均無(wú)危害，而鄭58和鄭單958的苞葉有大量蟲(chóng)孔，花絲被咬食嚴(yán)重，籽粒有部分發(fā)霉。本研究表明2個(gè)材料均表現(xiàn)較好的抗螟性。在抽穗期和灌漿期，HGK60和鄭單958H在雄穗、展開(kāi)葉和苞葉均有較高的轉(zhuǎn)錄水平，這與蛋白表達(dá)水平基本吻合。造成鄭單958H在抽穗期葉片的轉(zhuǎn)錄水平比雄穗低，與自交系HGK60的結(jié)果相反，而蛋白水平是雄穗的要比葉片的高，造成RNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)表達(dá)水平不一致的原因還未做深入研究。Makarevitch等［19］研究認(rèn)為特定品種的遺傳背景可以影響轉(zhuǎn)基因的表觀遺傳調(diào)控，DNA甲基化［20］、組蛋白修飾［21］、非編碼RNA調(diào)控［22］等可以造成基因序列不發(fā)生改變而轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生差異，其是否與表觀遺傳調(diào)控相關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。

從3個(gè)世代的物候期調(diào)查結(jié)果可以得出轉(zhuǎn)入Bt cry1Ah對(duì)玉米生育期的影響不大。而玉米生育期與緯度變化及種植當(dāng)?shù)氐姆e溫相關(guān)，有研究統(tǒng)計(jì)顯示隨著緯度的北移，播種-出苗和出苗-吐絲的時(shí)間顯著增加，緯度每增加1°，播種-出苗和出苗-出吐絲的時(shí)間分別延長(zhǎng)0.7 d和1.25 d，吐絲-出成熟的時(shí)間縮短0.8 d，玉米營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期占總生育期的比值隨著緯度的北移顯著增加，緯度每增加1°，比值增加1.34［23］。海南的積溫比廊坊積溫要高，緯度比廊坊低，在海南玉米的生育期要比在廊坊玉米的生育期短。因此，統(tǒng)計(jì)的3個(gè)世代物候期的差異是由于積溫和緯度等因素造成的，與轉(zhuǎn)入的Bt cry1Ah基因無(wú)關(guān)。

康領(lǐng)生等［24］將cry1F轉(zhuǎn)入玉米獲得轉(zhuǎn)基因玉米SW12-859，接蟲(chóng)與不接蟲(chóng)小區(qū)和鄭單958不接蟲(chóng)小區(qū)比較，玉米株高、穗位高、產(chǎn)量無(wú)顯著差異，玉米株型、生育期都一致。玉米SW12-859與鄭單958通過(guò)接蟲(chóng)區(qū)測(cè)產(chǎn)、考種比較，玉米穗長(zhǎng)、穗粗、百粒重、產(chǎn)量存在顯著差異。本研究中鄭單958H與鄭單958相比，不接玉米螟時(shí)，在同一世代株高、穗位高、穗長(zhǎng)、穗粗、穗行數(shù)、禿尖長(zhǎng)、行粒數(shù)、千粒重?zé)o顯著差異，接蟲(chóng)后的產(chǎn)量要比不接蟲(chóng)的產(chǎn)量低，接蟲(chóng)后的轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)量要比非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)量要高，且差異顯著。接蟲(chóng)后的鄭單958H和鄭單958產(chǎn)量都降低，這可能與田間模擬大量蟲(chóng)害爆發(fā)有關(guān)，葉片被咬食嚴(yán)重，受害葉片喪失功能，直接影響玉米光合作用，導(dǎo)致玉米植株生長(zhǎng)發(fā)育受阻，株高和產(chǎn)量受損。研究表明，培育出的鄭單958H雜交種有較好的育種價(jià)值。

從玉米種子上來(lái)看，本研究中轉(zhuǎn)基因玉米鄭單958H與非轉(zhuǎn)基因玉米鄭單958及HGK60與鄭58在發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)上沒(méi)有顯著差異，外源Bt cry1Ah基因的導(dǎo)入對(duì)玉米發(fā)芽活力方面沒(méi)有影響。這與王延鋒［25］將轉(zhuǎn)基因玉米與受體X90進(jìn)行比較得出外源cry1Ah的導(dǎo)入對(duì)玉米發(fā)芽活力沒(méi)有影響結(jié)果一致。

無(wú)論是自交種HGK60還是雜交種鄭單958H，都顯示出比鄭58及鄭單958較強(qiáng)的抗蟲(chóng)優(yōu)勢(shì)。在農(nóng)藝性狀等基本保持穩(wěn)定的前提下，還具有能穩(wěn)定遺傳的良好抗蟲(chóng)性，具有較強(qiáng)的育種前景。

4 結(jié)論

轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米自交種HGK60及雜交種鄭單958H具有良好的遺傳穩(wěn)定性和抗蟲(chóng)性，農(nóng)藝性狀趨于穩(wěn)定。