冠心病患者miR-19a表達(dá)及與預(yù)后關(guān)系的研究

康曉軍 ，王西輝

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟?，CHD）是常見(jiàn)的心血管疾病，主要是由動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的積聚引起冠狀動(dòng)脈（冠脈）狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死導(dǎo)致的心臟病[1,2]。盡管近年來(lái)在冠心病早期發(fā)現(xiàn)和治療方面取得了進(jìn)步，但CHD仍然是全球心源性猝死和住院的主要原因[3]。根據(jù)2012年的統(tǒng)計(jì)，4.5%的18歲以上的亞洲人患有CHD，到2030年，這種疾病的流行率預(yù)計(jì)將增加約18%[4]。內(nèi)皮細(xì)胞（EC）損傷和炎癥是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化形成的重要原因。微小RNA（miRNA）已被確定參與動(dòng)脈粥樣硬化的啟動(dòng)和發(fā)展，發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[5]。

miRNA是一類長(zhǎng)度在21-25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，可通過(guò)與靶mRNA的3’-非編碼區(qū)相結(jié)合，對(duì)靶基因mRNA進(jìn)行切割或翻譯抑制。MiR-19a位于染色體區(qū)域13q31.3，已經(jīng)證實(shí)MiR-19a與轉(zhuǎn)移性乳腺癌和結(jié)腸癌的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)[6,7]。研究表明，高脂血癥時(shí)，輕度氧化的低密度脂蛋白可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞中的HIF-1α表達(dá)，內(nèi)皮HIF-1α可觸發(fā)miR-19a介導(dǎo)的CXCL1表達(dá)和單核細(xì)胞粘附，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[8]。在動(dòng)脈粥樣硬化小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，尾靜脈注射miR-19a拮抗劑，可減少高脂肪飲食的apoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和脂質(zhì)負(fù)荷[9]。目前miR-19a在動(dòng)脈粥樣硬化方面的基礎(chǔ)研究已取得了一定進(jìn)展，而評(píng)估m(xù)iR-19a在心血管疾病患者中的表達(dá)及預(yù)后價(jià)值的研究還略顯不足，miR-19a在冠心病患者中的表達(dá)及預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值還不明確，本研究擬通過(guò)選取2014年1月～2016年6月于西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科就診的冠脈造影患者125例，Real-time PCR檢測(cè)外周血miR-19a表達(dá)并進(jìn)行隨訪，分析miR-19a在冠心病患者外周血中的表達(dá)及冠心病預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象隨機(jī)選取2014年1月～2016年6月于西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科接受的冠脈造影患者125例，其中，對(duì)照組20例（NC），穩(wěn)定性冠心病組（SCAD）63例，急性冠脈綜合征組（ACS）42例，診斷標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)照組患者以心前區(qū)不適入院，經(jīng)冠脈造影證實(shí)為冠狀動(dòng)脈無(wú)明顯狹窄病變。穩(wěn)定性冠心病組及急性冠脈綜合征組患者以計(jì)算機(jī)定量軟件分析冠脈造影結(jié)果，直徑法表示狹窄程度，據(jù)美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)冠脈血管計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)，左前降支、左冠脈主干、回旋支、右冠脈中的一支或以上血管內(nèi)徑狹窄≥50%，即診斷為冠心病而入組，參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)2009年發(fā)布的《臨床診療指南-心血管分冊(cè)》[10]，依據(jù)冠心病患者的臨床表現(xiàn)，分為穩(wěn)定性冠心病組及急性冠脈綜合征組。

排除標(biāo)準(zhǔn)：排除臨床資料不完善；嚴(yán)重肝、腎功能不全；惡性腫瘤；Ⅰ型糖尿?。粐?yán)重創(chuàng)傷、感染；無(wú)法按要求完成隨訪的患者。各組患者性別、年齡、吸煙史、高血壓史、糖尿病史等一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。入院后完善胸片、血生化、超聲心動(dòng)圖等實(shí)驗(yàn)室檢查。本研究經(jīng)患者及其家屬知情同意，并經(jīng)本院倫理研究委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施。

1.2 冠脈狹窄程度評(píng)分根據(jù)美國(guó)心臟病協(xié)會(huì)規(guī)定的冠狀動(dòng)脈血管圖像分段評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，以Gensini積分系統(tǒng)[11]進(jìn)行定量評(píng)分：無(wú)任何異常為0分；狹窄＜25%記1分；25%≤狹窄＜50%記2分；50%≤狹窄＜75%記4分；75%≤狹窄＜90%記8分；90%≤狹窄＜99%記16分；100%閉塞記32分。不同階段冠脈評(píng)分系數(shù)為左主干×5.0；前降支近段×2.5，中段×1.5，遠(yuǎn)段×1.0；回旋支近段×2.5，中段×1.0，遠(yuǎn)段×1.0；右冠狀動(dòng)脈近段、中段及遠(yuǎn)段×1.0；小分支×0.5。各分支積分之和為最終積分，結(jié)果由兩位心內(nèi)科醫(yī)師判定。

1.3 血清miR-19a表達(dá)測(cè)定患者于確診后即刻抽取外周靜脈血2 ml，裝入抗凝管中，4℃冰箱保存，24 h內(nèi)離心分離血清，24 h內(nèi)提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后行Real-time PCR檢測(cè)miR-19a表達(dá)水平，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，以U6為內(nèi)參。MiR-19a引物序列：上游5’-TGCGCTG TGCAAATCTATGCAAA-3’，下游5’-CCAGT GCAGGGTCCGAGGT-3’；內(nèi)參U6引物序列：5’-GCTTCGGCAGCACATCTCATAAAAT-3’，5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。反應(yīng)條件：95℃，3min；40個(gè)PCR循環(huán)（95℃，15 s；55℃，20 s；72℃，20 s；83.5℃，15 s）。95℃，15 s；60℃，1 min；95℃，15 s；繪制熔解曲線。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，以2-△△CT值法進(jìn)行相對(duì)定量分析。將穩(wěn)定性冠心病組及急性冠脈綜合征組患者以miR-19a相對(duì)表達(dá)量分為兩組，△CT小于△CT平均值為miR-19a高表達(dá)組（H-level），反之為低表達(dá)組（L-level）。

1.4 出院后隨訪出院后每月定期電話隨訪或者門診隨訪，記錄所有患者出院后的主要心臟不良事件（非致死性心肌梗死、死亡、血運(yùn)重建等情況），心肌梗死判定：持續(xù)20 min以上的胸痛或心電圖出現(xiàn)新的異常改變并伴有肌鈣蛋白異常增高；血運(yùn)重建判定：經(jīng)過(guò)外科手術(shù)或介入術(shù)對(duì)以往病變血管的再次治療或?qū)ρ苄掳l(fā)狹窄的治療，隨訪1～47個(gè)月，平均隨訪時(shí)間31.2個(gè)月。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，后續(xù)組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，兩指標(biāo)間相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組患者一般臨床資料比較各組患者性別、年齡、吸煙史、高血壓史、糖尿病史、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、三酰甘油（TG）、尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表1）。

2.2 各組患者miR-19a表達(dá)水平比較冠心病患者各分組miR-19a表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.013），急性冠脈綜合征組患者miR-19a水平較穩(wěn)定性冠心病組表達(dá)升高更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.026）（圖1）。

2.3 不同miR-19a表達(dá)水平患者Gensini評(píng)分比較急性冠脈綜合征組患者Genisini總體評(píng)分高于穩(wěn)定性冠心病組患者（P=0.041）。兩組患者依據(jù)miR-19a表達(dá)水平細(xì)分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，miR-19a高表達(dá)組的患者較低表達(dá)患者Gensini評(píng)分更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.033，0.025）。

2.4 不同miR-19a表達(dá)水平患者主要心臟不良事件發(fā)生率分析經(jīng)平均時(shí)間31.2個(gè)月的隨訪后發(fā)現(xiàn)，miR-19a高表達(dá)的穩(wěn)定性冠心病及急性冠脈綜合征患者具有較高的主要心臟不良事件總體發(fā)生率及死亡率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.041，0.038）。miR-19a高表達(dá)的急性冠脈綜合征患者血管重建發(fā)生率亦較高（P=0.029）。經(jīng)Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，miR-19a表達(dá)水平與入組的冠心病患者主要心臟不良事件總體發(fā)生率正相關(guān)（r=0.643，P=0.009）（表2）。

表1 各組患者臨床資料比較[（±s），（n，%）]

表1 各組患者臨床資料比較[（±s），（n，%）]

注：TC：總膽固醇；TG：三酰甘油；LDL：低密度脂蛋白；HDL：高密度脂蛋白；BUN：尿素氮；Cr：肌酐

項(xiàng)目 對(duì)照組（n=20） 穩(wěn)定性冠心病組（n=63） 急性冠脈綜合征組（n=42） χ2/F值 P值男性 9（45.00） 34（53.96） 22（52.38） 0.876 0.834吸煙史 10（50.00） 25（39.68） 23（54.76） 2.431 0.472高血壓 8（40.00） 27（42.86） 26（61.90） 4.030 0.286糖尿病 6（30.00） 16（25.40） 15（35.71） 1.230 0.741年齡（歲） 61.23±9.34 62.21±8.91 64.12±9.56 1.120 0.534 TC（mmol/L） 4.46±0.62 4.51±0.71 4.55±0.69 1.430 0.216 TG（mmol/L） 1.52±0.96 1.69±0.81 1.73±0.95 0.634 0.591 LDL（mmol/L） 2.79±0.77 2.71±0.61 2.68±0.67 1.043 0.372 HDL（mmol/L） 1.21±0.31 1.16±0.28 1.15±0.27 0.496 0.691 BUN（mmol/L） 5.21±2.21 4.93±2.42 4.51±2.39 0.183 0.904 Cr（μmol/L） 57.32±20.06 59.43±21.32 56.82±23.39 0.048 0.972

圖1 miR-19a在對(duì)照組、穩(wěn)定性冠心病組、急性冠脈綜合征組表達(dá)水平比較

圖2 miR-19a高、低表達(dá)組冠心病患者Gensini評(píng)分比較

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化仍然是對(duì)人類健康的最大威脅之一，其啟動(dòng)，預(yù)防和治療需要廣泛的生物和醫(yī)學(xué)研究[12]。miR-19a是miR-17-92多順?lè)醋踊虼氐闹匾蓡T，目前的研究發(fā)現(xiàn)miR-19a所在的基因簇可以在動(dòng)脈粥樣硬化期間被激活，促進(jìn)血管炎癥和泡沫細(xì)胞的形成[13]。miR-19a還被發(fā)現(xiàn)可在缺氧誘導(dǎo)因子和剪切應(yīng)激下的內(nèi)皮血管細(xì)胞中上調(diào)，增加內(nèi)皮血管細(xì)胞的增殖和抗凋亡能力[8]。

動(dòng)脈粥樣硬化的動(dòng)物模型為miR-19a在體內(nèi)的作用提供了更多的證據(jù)。高脂飲食的ApoE-/-小鼠經(jīng)miR-19a拮抗劑處理，組織學(xué)分析胸主動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈標(biāo)本后發(fā)現(xiàn)小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和脂質(zhì)含量明顯減少，以上證據(jù)表明miR-19a抑制可減輕炎癥反應(yīng)，減緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-19a在冠狀動(dòng)脈疾病患者的血清和動(dòng)脈粥樣硬化病變中升高，可能是動(dòng)脈粥樣硬化的啟動(dòng)因素之一[14]。本研究中也證實(shí)了血清miR-19a在冠心病患者中的表達(dá)明顯升高，而且在急性冠脈綜合征的患者升高的更為明顯，說(shuō)明血清miR-19a水平可能部分反映了冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度，為臨床醫(yī)生判斷冠脈病變情況及病情提供依據(jù)。

表2 各組患者主要臨床不良事件發(fā)生情況（n，%）

不同miR-19a表達(dá)水平患者的Gensini評(píng)分提示，miR-19a與冠脈狹窄程度密切相關(guān)，miR-19a過(guò)表達(dá)的患者Gensini評(píng)分較低表達(dá)患者更高，冠脈狹窄更嚴(yán)重，這可能是由于miR-19a在冠心病患者的血液和組織中高度富集，導(dǎo)致miR-19a的靶基因HMG盒轉(zhuǎn)錄因子1（HBP1）表達(dá)抑制，進(jìn)而對(duì)抑制巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（MIF）17的調(diào)控作用喪失。miR-19a抑制HBP1表達(dá)并上調(diào)MIF導(dǎo)致炎性因子腫瘤壞死因子（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）的釋放，促進(jìn)血管炎癥反應(yīng)。另外，在基礎(chǔ)研究中發(fā)現(xiàn)，TNF-α還可進(jìn)一步介導(dǎo)miR-19a的表達(dá)，產(chǎn)生放大作用，嚴(yán)重的血管炎癥可造成冠狀動(dòng)脈的狹窄甚至閉塞[15]。這些研究結(jié)果皆提示miR-19a的靶向抑制可能是緩解冠脈狹窄的治療手段之一。

目前對(duì)miR-19a與冠心病預(yù)后的相關(guān)研究還略顯不足，本研究發(fā)現(xiàn)，miR-19a高表達(dá)意味著更高的死亡率及主要心臟不良事件的總體發(fā)生率，還對(duì)急性冠脈綜合征患者的血運(yùn)重建有調(diào)控作用。原因可能不僅是miR-19a對(duì)血管炎癥的加重作用，還與miR-19a介導(dǎo)的ADRB1表達(dá)抑制有關(guān)，ADRB1的正常表達(dá)對(duì)維持心臟調(diào)節(jié)功能的核心β-腎上腺素受體（β-AR）及其相關(guān)的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸調(diào)節(jié)蛋白（G蛋白）/腺苷酸環(huán)化酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有重要意義，其表達(dá)抑制可造成心肌細(xì)胞功能異常，導(dǎo)致心力衰竭及左室射血分?jǐn)?shù)降低[16]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定性冠心病及急性冠脈綜合征患者的血清miR-19a表達(dá)明顯升高，miR-19a高表達(dá)意味著更嚴(yán)重的冠脈狹窄以及更高的主要心臟不良事件的發(fā)生率，血清miR-19a表達(dá)水平與冠心病患者主要心臟不良事件的發(fā)生率呈正相關(guān)。血清miR-19a表達(dá)水平監(jiān)測(cè)可為臨床醫(yī)生判斷冠心病嚴(yán)重程度及預(yù)后分析提供參考，靶向抑制miR-19a可能成為緩解冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的潛在治療手段。