LPA rs3798220位點基因單核苷酸多態(tài)性與冠心病及2型糖尿病合并冠心病的關(guān)系

黨海明，王瑩，楊明，葉益聰，曾勇

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┦且环N臨床常見的心臟疾病，具有較高的發(fā)病率和致殘率，常給患者及社會帶來沉重負擔，危險因素有糖尿病、高血壓、高血脂、吸煙、肥胖等[1]，而糖尿病是一種糖代謝性疾病，異常升高的血糖帶來的影響會累及全身各個系統(tǒng)，包括循環(huán)系統(tǒng)。兩者的發(fā)病基礎(chǔ)可能與內(nèi)皮受損、氧化應(yīng)激及炎性因子等有關(guān)，臨床上糖尿病為冠心病的危險因素，可加重冠心病的發(fā)生、發(fā)展，冠心病患者更易出現(xiàn)糖代謝紊亂。多項研究顯示，脂蛋白a水平與人群心血管疾病危險性有關(guān)[2-6]，在2型糖尿病合并冠心病患者中，血清脂蛋白a水平升高[7,8]，楊銳能等[9]研究發(fā)現(xiàn)，血清脂蛋白a水平升高的2型糖尿病患者心血管疾病發(fā)生風險明顯升高，多項研究發(fā)現(xiàn)，LPA rs3798220位點（C/T）不同基因型與血清脂蛋白a水平相關(guān)，本研究旨在分析LPA rs3798220位點（C/T）基因多態(tài)性與冠心病及2型糖尿病合并冠心病發(fā)病的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 對象與分組入選研究對象共450例，均來自北京協(xié)和醫(yī)院和北京安貞醫(yī)院心內(nèi)科冠心病數(shù)據(jù)庫（數(shù)據(jù)庫建立于2009年1月，連續(xù)納入于心內(nèi)科行冠狀動脈（冠脈）造影的患者，截止至2018年2月，該數(shù)據(jù)庫共納入3321例患者）。根據(jù)冠脈造影結(jié)果和是否合并2型糖尿病，分為冠心病組150例，聯(lián)合組150例（2型糖尿病合并冠心?。┖蛯φ战M150例（無2型糖尿病及冠心?。Ｋ鸭脒x對象的相關(guān)臨床資料，包括患者的一般資料：姓名、性別、年齡；既往病史，包括是否有高血壓、2型糖尿病、冠心病、血脂異常等；體格檢查包括血壓、腰圍、并計算BMI（身高/體重，kg/m2）；三組之間進行年齡、性別、BMI的匹配。排除嚴重感染者、嚴重肝腎功能不全者。

1.2 診斷標準冠心病診斷標準為左主干、左前降支、左回旋支及右冠中至少有一支狹窄程度≥50%，在本研究中，入選了至少一支冠狀動脈主要分支直徑狹窄大于75%，且符合美國心臟病協(xié)會冠心病診斷標準者入選至冠心病組；冠狀動脈造影所有冠狀動脈主要分支直徑狹窄均不大于25%且臨床上無相關(guān)心肌缺血證據(jù)者入選至對照組。2型糖尿病診斷按照1999年WHO標準。

1.3 檢測方法使用OMEGA公司提供的全血基因組DNA提取試劑盒E.Z.N.A.TMBlood DNA Midi Kit提取所有患者全血標本DNA，采用 AssayDesigner 3.1軟件進行引物序列設(shè)計后，應(yīng)用Sequenom MassARRAY?SNP 檢測過程結(jié)合多重 PCR 技術(shù)、MassARRAY iPLEX 單堿基延伸技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜分析（MALDI-TOF）進行分型檢測。將包含SNP位點區(qū)域的DNA模板通過PCR技術(shù)擴增，再使用特異的延伸引物與PCR產(chǎn)物進行單堿基延伸反應(yīng)。由于多態(tài)性位點堿基不同，延伸產(chǎn)物不同的末端堿基將導致延伸后的產(chǎn)物分子量的差異，因此由SNP多態(tài)性引起的堿基差異通過分子量的差異而體現(xiàn)，通過基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜分析質(zhì)譜技術(shù)，檢測延伸產(chǎn)物分子量的大小，應(yīng)用專用的分析軟件，通過判斷分子量的差異而進行SNP分型檢測，從而確定LPA rs3798220位點堿基。設(shè)計的引物序列為cccccAACAGCCTAGACACTTCT。研究通過我院倫理委員會批準（批文號s-448）。

1.4 統(tǒng)計學處理本研究使用SPSS 20.0軟件對SNP分型結(jié)果進行分析，并分別計算等位基因頻率與基因型頻率的關(guān)聯(lián)結(jié)果，在群體水平上研究冠心病與遺傳標記的相關(guān)性。計量資料采用（±s）表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用例數(shù)（構(gòu)成比）表示，組間比較采用χ2檢驗。二分類比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 納入對象基本情況冠心病組平均年齡（64.01±8.38）歲，聯(lián)合組（63.91±8.28）歲，對照組（63.07±10.56）歲，未發(fā)現(xiàn)年齡分布在組間存在有統(tǒng)計學差異（P=0.624）。三組男性均為117例，占78%，未發(fā)現(xiàn)性別分布在組間有統(tǒng)計學差異（P=1.0）。冠心病組BMI均值25.61±3.41，聯(lián)合組25.63±3.24，對照組25.34±3.67，未發(fā)現(xiàn)BMI在組間具有統(tǒng)計學差異（P=0.716），冠心病組既往高血壓、血脂異常、吸煙飲酒史者分別為110例、82例和41例，占77.5%、54.7%和27.3%，聯(lián)合組人數(shù)分別為122例、110例和51例，分別占81.3%、73.3%和34%，對照組人數(shù)為83例、93例和28例，分別占55.3%、62%和18.7%，卡方檢驗發(fā)現(xiàn)以上指標在組間有顯著統(tǒng)計學差異（P均＜0.05，表1）。

2.2 三組間LPA rs3798220位點（C/T）等位基因頻率的關(guān)聯(lián)分析將冠心病組、聯(lián)合組和對照組三組受試者進行等位基因頻率關(guān)聯(lián)分析。表中依次列出了三組之間兩種等位基因?qū)?yīng)的堿基和等位基因頻數(shù)。三組間LPA rs3798220位點（C/T）的等位基因頻率有顯著性差異（P=0.03），其中，該位點等位基因C在冠心病組頻率為11.1%，在聯(lián)合組組中為6.7%，在對照組組中頻率為5.7%，進一步分析得出在冠心病組中，等位基因C的基因頻率明顯高于對照組（P=0.01），提示C等位點較T等位基因位點的致冠心病的風險高。與對照組相比，聯(lián)合組的等位基因頻率未見顯著統(tǒng)計學差異（P＞0.05，表2）。

2.3 三組之間LPA rs3798220位點（C/T）基因型頻率的關(guān)聯(lián)分析將冠心病組、聯(lián)合組和對照組三組受試者進行基因型頻率關(guān)聯(lián)分析。表中依次為三組中LPA rs3798220位點三種基因型所對應(yīng)的基因型和基因型在兩組中的頻數(shù)。與對照組相比，冠心病組和聯(lián)合組的LPA rs3798220位點（C/T）在三個基因型頻率方面均未見顯著統(tǒng)計學差異（P＞0.05，表3）。

3 討論

脂代謝異常目前被公認為是冠心病發(fā)病的重要危險因素之一，血脂紊亂不僅引起糖代謝紊亂而促進糖尿病的發(fā)生發(fā)展，還可顯著促進冠心病患者冠脈粥樣硬化性病變的發(fā)展。脂蛋白a是一種特殊的低密度脂蛋白，由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)構(gòu)成，于1963年被Berg首次發(fā)現(xiàn)后，逐漸成為研究熱點，研究認為，高水平的脂蛋白a與冠狀動脈粥樣硬化發(fā)生有著密切的相關(guān)性[2]，

表1 各組一般臨床資料比較

趙偉林等研究認為，高水平的脂蛋白a水平為冠心病發(fā)生的獨立危險因素，其濃度主要由遺傳因素決定[3]，其促進冠心病發(fā)生的主要機制為損傷內(nèi)皮功能，促進脂質(zhì)斑塊形成和平滑肌增殖，參與動脈內(nèi)膜的損傷及功能紊亂的過程。一些早期觀察性研究和Meta分析及前瞻性研究已經(jīng)證實脂蛋白a是冠狀動脈疾病的一個危險因素[4-6]。2型糖尿病與冠心病雖不屬于一種疾病，但兩者在危險因素、發(fā)病機制等方面，密切相關(guān)、互相影響。糖尿病患者中有75%死于心血管病[18]。任聰慧、朱春海等[7,8]研究證實，2型糖尿病合并冠心病患者血脂蛋白a水平明顯高于健康人群。目前有學者認為，血清脂蛋白a濃度主要受apo(a)基因影響[19,20]，其遺傳性占90%，近幾年多項遺傳學方面的研究已得出LPA基因多態(tài)性與不同種族人群的脂蛋白a高水平相關(guān)[10-12]，已有多項大規(guī)模遺傳學研究分別在不同人種中證實了LPA rs3798220，rs10455872，rs1853021，rs10455872，rs6415084以及rs9457951等位點均與血脂蛋白a相關(guān)[13-17]。

LPA rs3798220位點位于LPA基因的蛋白promoter區(qū)，一項針對歐洲人群的大規(guī)模隨機對照研究發(fā)現(xiàn)， LPA rs3798220位點不同基因型與血清脂蛋白a水平和心血管疾病發(fā)生相關(guān)[19]。Daniel和Radahd等在大規(guī)?；旌先巳褐醒芯堪l(fā)現(xiàn)，其C等位基因增加冠心病發(fā)病風險和血清脂蛋白a水平[20]，本研究中，通過“病例-對照”關(guān)聯(lián)分析，對LPA rs3798220位點（C/T）等位基因頻率和基因型頻率在冠心病組、2型糖尿病合并冠心病聯(lián)合組和對照組之間進行比較，結(jié)果顯示，比較三組間基因型頻率的差別，未見顯著差異，而等位基因頻率在三組間顯示有統(tǒng)計學差異，進一步分析，與健康對照組相比，冠心病組的C等位基因頻率明顯增高，認為C等位基因與冠心病發(fā)生相關(guān)，C等位基因相對于T等位基因具有致冠心病風險。與對照組相比，聯(lián)合組的等位基因頻率和基因型頻率均未見顯著統(tǒng)計學差異，故其可能不是2型糖尿病合并冠心病的危險因素。

本研究在分組之間進行了年齡、性別、BMI的匹配，盡可能減少了其他因素對SNP位點對發(fā)病影響的干擾。不足之處為本研究通過冠狀動脈造影明確冠心病而通過無心絞痛病史排除冠心病，而無排除冠心病的客觀證據(jù)，可能存在一定的選擇偏倚。

綜上所述，本研究得出LPA rs3798220位點（C/T）基因單核苷酸多態(tài)性可能與冠心病發(fā)生相關(guān)，而未發(fā)現(xiàn)其與2型糖尿病合并冠心病的易感性相關(guān)。由于群體間遺傳異質(zhì)性和樣本量的限制，擴大樣本量、嚴格全面收集臨床資料、并在不同人群中進行驗證以及開展相關(guān)功能研究，可能是未來進行LPA基因單核苷酸多態(tài)性與疾病關(guān)聯(lián)研究中需要解決的問題，期待未來可以通過基因方面的檢測來輔助診斷疾病、指導預后及治療。

表2 LPA rs3798220位點（C/T）等位基因頻率的關(guān)聯(lián)分析

表3 LPA rs3798220位點（C/T）基因型頻率的關(guān)聯(lián)分析