CRP基因多態(tài)性與缺血性腦卒中和血清CRP的關聯(lián)研究

趙中垚，劉迪，孫琦，王友信

腦卒中的發(fā)病率有逐年上升的趨勢，由于其較高的致殘率和致死率，腦卒中已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。根據(jù)2013年的全球疾病負擔顯示，腦卒中已成為我國疾病負擔最為嚴重的疾病[1]。腦卒中分為缺血性腦卒中和出血性，而缺血性腦卒中約占到總卒中患者的80%[2]。C-反應蛋白（CRP）做為一種急性反應蛋白，是腦卒中研究當中的一種重要的生物標志物[3]。有研究表明，CRP可以通過促進對單核巨噬細胞及內皮細胞[4]等的炎癥反應，從而導致動脈粥樣硬化。然而另有研究表明，CRP并未參與缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展[5,6]。因此，CRP在腦卒中的發(fā)病機制中的作用尚不明確，有研究表明CRP的基因多態(tài)性與CRP水平的個體差異有關，本研究分析了CRP基因多態(tài)性對缺血性腦卒中及CRP濃度的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇2010年1月～2012年12月，于北京天壇醫(yī)院就診診斷為缺血性腦卒中患者共378例，其中男性284例，女性94例，年齡20～86（55±11）歲，同期健康體檢人群613例為對照組，其中男性197例，女性416例，年齡27～68（47±5）歲。入組患者診斷均符合世界衛(wèi)生組織（WHO）診斷標準，經頭顱CT或MRI證實。排除標準：排除感染性疾病、腫瘤、免疫缺陷、缺血性心臟病、心肌病、肝腎功能不全、其他腦血管疾病等。

1.2 標本采集所有患者入院后首先搜集一般臨床病史資料?；颊呷朐?4 h內抽取靜脈血液樣本化驗相關生化指標，包括：空腹血糖（FPG）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC） 、高密度膽固醇脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測其CRP水平，使用美國R&D Human CRP DuoSet試劑盒。

1.3 CRP基因分型從Ensembl在線數(shù)據(jù)庫（http://www.ensembl.org）入選了5個與CRP相關的SNP（rs1130864，rs1205，rs2794521，rs3093059，rs876537），入選標準為最小等位基因頻率＞0.05，且r2＞0.8。選擇全自動DNA提取儀提取外周血白細胞基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度與純度，通過多重PCR技術、iPLEX單堿基延伸技術和MALDI-TOF技術進行CRP基因多態(tài)性的基因分型。5 μl的反應體系包括：dddH2O 1.8Μl，10×buffer 0.5 μl，mg2+0.4 μl, dNTP 0.1 μl，Hotstar 0.2 μl，上下游引物1 μl，DNA模板1 μl。PCR擴增反應擴增程序：95℃預變性2 min，95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸60 s，共45個循環(huán)，最后72℃延伸5 min，4℃保存待用。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)。大部分計量數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，CRP呈偏態(tài)分布，統(tǒng)計分析使用CRP對數(shù)轉換log-CRP，使用計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，兩組之間CRP基因型的比較使用卡方檢驗，不同基因型血清CRP的濃度的比較使用單因素的方差分析，以Logistic回歸模型評價CRP在缺血性腦卒中的影響，分別得出比值比（OR）與95%置信區(qū)間（95%CI）。

2 結果

2.1 一般項目及生化指標測定缺血性腦卒中患者中男性多于女性，有著較高的體質指數(shù)和血壓。兩組患者FPG、TC、HDL-C、LDL-C、CRP比較差異均存在統(tǒng)計學差異（P＜0.01）（表1）。

2.2 兩組CRP基因型的比較對照組中5個SNP的基因型均符合Hardy-Weinberg平衡。其中rs1130864中AA基因型在兩組中均少見，且IS組內AG基因型和A等位基因頻率顯著高于對照組（P＜0.01），而rs2794521中TC基因型在IS組中更為常見，但是C等位基因頻率在兩組沒有顯著性差異（表2～3）。

2.3 CRP基因型與血清CRP濃度的關系在對照組中，5個SNP中有3個SNP（rs876537，rs1205，rs3093059）與血清CRP濃度相關。在缺血性腦卒中組中，只有rs876537與血清CRP相關，且TC基因型患者中血清CRP濃度高于TT，CC基因型患者。

表1 IS組和對照組的基本資料比較

表2 兩組CRP基因SNPs的基因型頻率的比較

表3 兩組CRP基因SNPs等位基因頻率的比較

2.4 血清CRP與缺血性腦卒中的關系校正年齡與性別后，血清CRP水平每增加一倍，患缺血性腦卒中的危險就會增加13%（3.4%～23.4%，P=0.007）；校正年齡、性別、體質指數(shù)（BMI），收縮壓，TC，HDL-C后，血清CRP水平每一倍的升高會增加12%的危險。

3 討論

本研究采用病例對照研究，對缺血性腦卒中患者及健康對照的血清CRP濃度及CRP基因的SNPs進行檢測，發(fā)現(xiàn)rs1130864位點中AG基因型與缺血性腦卒中的發(fā)病相關，AA基因型在漢族人群中較為罕見。rs876537，rs1205，rs3093059與自然人群中血清CRP水平相關；在病例組，只有rs876537與血清CRP水平相關。多重校正后，CRP水平每增加一倍，患IS的風險增加12%。

表4 SNP不同基因型間CRP濃度的比較

rs1130864與缺血性腦卒中的關聯(lián)研究已多次被報道，但其結果卻存在爭議。Du等[7]在一項病例對照研究中發(fā)現(xiàn)，rs1130864與rs3053059與其單體型與缺血性腦卒中均不相關。而陳芳等[8]研究結果表明rs1130864隱形模型（AA+GA）為缺血性腦卒中的危險因素，與本研究結果一致。在另一項包括了1716例IS患者的研究結果表明，在調整了潛在的混雜因后，rs1130864是缺血性腦卒中發(fā)病三月內不良結局的預測因子[9]，因此，rs1130864對缺血性腦卒中的影響還需在大規(guī)模人群中驗證。

個體CRP水平是受遺傳因素的影響可達到22%～56%[10,11]，Morten等研究表明，在歐洲人群CRP基因4個SNP（rs3091244，rs1130864，rs1205，rs3093077）的基因型組合最多可解釋62%的CRP水平的變異[12]。在一項針對中國人群的橫斷面研究當中，rs3093059和rs1205與高水平的CRP濃度相關。在一項研究對象為亞洲人群的GWAS研究中，rs876537被認為是與CRP水平最具有相關性的一個位點[13]。Shen等[14]發(fā)現(xiàn)rs876537在缺血性腦卒中組與對照組都與CRP水平相關，與本研究結果一致。

本研究結果顯示CRP為缺血性腦卒中發(fā)病的危險因素，其基因中的rs1130864與缺血性腦卒中的發(fā)病相關，在自然人群中rs1205，rs876537，rs3093059與CRP濃度相關。由于CRP為心血管疾病的重要預測因子，但其因果關系尚不明確。探究基因型-CRP-腦卒中的關系可以為下一步的孟德爾隨機化研究打下研究基礎。