HPLC 法測(cè)定芪五加顆粒中紫丁香苷的含量

陳文云，鐘水燕，范傳園

（1.江西省獸藥飼料監(jiān)察所，南昌330029；2.江西中成中藥原料有限公司，南昌331700）

芪五加顆粒是依據(jù)《中藥部頒標(biāo)準(zhǔn)》第6冊(cè)第42頁“北芪五加片”的處方、工藝制成的改劑型產(chǎn)品，由黃芪浸膏、刺五加浸膏組方制成的顆粒劑。具有益氣，健脾，安神功能，用于家禽免疫低下等。根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)[1]，方中黃芪含有皂苷類等有效成分，《中國獸藥典》收載的HPLC法測(cè)定黃芪中的黃芪甲苷采用蒸發(fā)光散射器檢測(cè)器，適用性、普遍性、經(jīng)濟(jì)性不高。另根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2]采用柱前衍生化法，研究了本品黃芪甲苷柱前衍生化含量測(cè)定方法，結(jié)果回收率、精密度、重現(xiàn)性等指標(biāo)均不符合要求。方中另一味中藥刺五加，其有效成分為紫丁香苷，關(guān)于紫丁香苷的HPLC測(cè)定方法已有很多文獻(xiàn)報(bào)道[4-6]。為有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，建立HPLC法測(cè)定芪五加顆粒中紫丁香苷的含量，并進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果表明該方法簡(jiǎn)便快速，重現(xiàn)性、穩(wěn)定性較好，精密度較高，可作為該制劑的定量控制指標(biāo)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 SyltechLC500高效液相色譜儀（賽爾泰（杭州）科技有限公司）；浙大N2000色譜數(shù)據(jù)工作站；92SM-202A-DR電子天平 （上海普利塞斯國際貿(mào)易有限公司）；MA110電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；101-1AB型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）；超聲波提取器 JL180（220V，50HZ）。

1.2 試藥 芪五加顆粒（批號(hào)2011050601、2011050801、2011051001），其中黃芪浸膏的工藝來源于“北芪五加片”附注黃芪浸膏的制法，刺五加浸膏的工藝依照文獻(xiàn)[3]，顆粒劑的成型工藝由江西中成中藥原料有限公司研究；紫丁香苷對(duì)照品（111574-200502，供含量測(cè)定用）購自中國藥品生物制品檢定所；乙腈為色譜純，購自上海精細(xì)化工有限公司公司；水為二重蒸餾水；其它試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：迪馬Diamonsil C18（5μm×250mm×4.6mm）；流動(dòng)相：乙腈-水-冰醋酸（10：90：1）； 流速：1.0mL/min； 檢 測(cè)波長265nm；進(jìn)樣量20μL；理論塔板數(shù)按紫丁香苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取紫丁香苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含40μg的溶液，即得。2.3供試品溶液的制備 取本品，研細(xì)，混勻，取約5g，精密稱定，置 25ml量瓶中，加甲醇 20ml，超聲處理30分鐘，放冷，再加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取紫丁香苷對(duì)照品12.97mg置于100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取2.0、4.0、8.0、12.0、20.0mL置于25mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即分別得濃度為 10.376、20.750、41.504、62.256、103.760μg·mL-1。按上述色譜條件，分別進(jìn)樣20μL，記錄峰面積積分值，以紫丁香苷峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)、紫丁香苷進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1），計(jì)算，得回歸方程y=3E+06x+601081（r=0.9991，n=5）。結(jié)果表明紫丁香苷含量在為0.2075～2.075μg范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，每次20μL，分別測(cè)定峰面積積分值，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.12%，表明進(jìn)樣方法的儀器精密性可達(dá)到測(cè)定要求。

2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取同一批芪五加顆粒（批號(hào) 2011050601）樣品 5 份，分別按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣20μL，結(jié)果紫丁香苷峰面積積分值相對(duì)平均偏差為1.26%，表明樣品處理方法重現(xiàn)良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液和同一供試品溶液， 分別在 0、4、8、12、24 小時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，紫丁香苷對(duì)照品峰面積積分值的RSD%為1.14%（n=5），供試品紫丁香苷峰面積積分值的RSD%為1.22%（n=5），說明紫丁香苷至少在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的芪五加顆粒（批號(hào)2011050601）5份，每份約5.0g，精密稱定，于每份中分別精密加入紫丁香苷對(duì)照品溶液，按供試品溶液的制備方法制備，以上述的色譜條件下，吸取供試液20μL進(jìn)樣，依法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率97.91%，RSD=0.97%（n=5）。結(jié)果（見表1）。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定 取樣品3批，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，對(duì)照品溶液與供試品溶液各進(jìn)樣20μL，分別測(cè)定紫丁香苷含量（見表2）。

表2 樣品中紫丁香苷的含量（n=3）

圖1 -標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 -紫丁香苷對(duì)照

圖3 -芪五加顆粒樣品

圖4 -芪五加顆粒樣品

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇 先參照文獻(xiàn)[3]收載的刺五加藥材和刺五加浸膏中紫丁香苷的HPLC含量測(cè)定方法，流動(dòng)相為甲醇：水（20∶80），結(jié)果表明芪五加顆粒中紫丁香苷的峰型前延，分離度較差(見圖4)。后根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[4-6]，比較不同比例的乙腈-水、甲醇-水、甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-冰醋酸、甲醇-水-磷酸、乙腈-水-磷酸等多種溶劑系統(tǒng)作為流動(dòng)相進(jìn)行考察，結(jié)果以乙腈-水- 冰醋酸（10∶90∶1）為流動(dòng)相，所得紫丁香苷峰形良好，峰形尖銳且對(duì)稱性好，分離度高，效果較好(見圖 2、3)。

3.2 測(cè)定波長的選擇 通過對(duì)紫丁香苷對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長掃描，在265nm處有最大吸收。并參考有關(guān)文獻(xiàn)[4-6]，紫丁香苷在265nm處有最大吸收，且紫丁香苷峰基本無干擾，故選擇265nm為檢測(cè)波長。

3.3 供試品處理方式的選擇 通過比較水、甲醇、10%甲醇、50%甲醇、乙醇、60%乙醇、正丁醇為提取溶劑，結(jié)果采用甲醇作為提取溶劑提取率最高，效果最好?？疾炝顺曁幚?0min、20min、30min、1h及加熱回流30min、1h，結(jié)果表明超聲30min，紫丁香苷基本提取完全且雜質(zhì)相對(duì)比回流的量要少，故定供試品的提取方法為超聲30min。

3.4 結(jié)論 本文采用高效液相色譜法測(cè)定了芪五加顆粒中紫丁香苷的含量，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，可以作為芪五加顆粒的質(zhì)量控制指標(biāo)。