大蒜提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果觀察

郭永剛，胡立磊，樊克鋒，陳志明，朱小龍

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院，鄭州450011；2.河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，鄭州451191；3.江西省動物疫病預(yù)防控制中心，南昌330096；4.江西省永新縣畜牧獸醫(yī)局）

大蒜屬于百合科蔥屬植物蒜的鱗莖，味辣、性溫，在我國種植廣泛，在人們?nèi)粘Ｉ钪惺且环N常用的調(diào)味品，廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)[1]。目前，隨著對于大蒜及其提取物研究的深入，該類物質(zhì)也逐漸開始應(yīng)用于醫(yī)藥和畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖等行業(yè)[2-3]。研究表明，大蒜中所含的抗菌成分如大蒜素對多種細(xì)菌和寄生蟲等均有抑制和殺滅作用，而且該類物質(zhì)無藥物殘留、無耐藥性，可替代部分臨床使用的抗生素及合成抗菌藥物。本試驗通過研究大蒜提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果，旨在為臨床合理使用大蒜提取物防治細(xì)菌感染性疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 大蒜產(chǎn)自河南省鄭州市中牟縣，購于陳寨蔬菜市場。

1.1.2 菌種大腸桿菌（ATCC25922），金黃色葡萄球菌(ATCC25923)，購自中國獸醫(yī)藥品檢查所，由河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院藥劑學(xué)實驗室保存。

1.1.3 試劑無水乙醇、MH營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 大蒜提取物液的制備選取成熟、干燥的大蒜剝皮清洗干凈并晾干表面水分，準(zhǔn)確稱取100g，用研缽搗成糊狀，加入95%的乙醇400mL，室溫萃取2h,以3500r/min離心20min，取上層清液于燒杯中，轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中以轉(zhuǎn)速60r/min，溫度50℃濃縮至濃度為1g/mL的大蒜提取液，提取液用微孔濾膜過濾，所得濾液于4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌液制備 將本實驗室分離保存的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別接種于瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，選擇典型菌落接種于MH營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h后，采用平板計數(shù)法進行菌落計數(shù)，將菌液稀釋至濁度為1x108cfu/mL備用。

1.2.3 抑菌試驗采用牛津杯法測定抑菌圈直徑。取滅菌后45℃左右的瓊脂培養(yǎng)基15mL，導(dǎo)入已滅菌的平皿中，培養(yǎng)基厚度約為4mm，待冷卻凝固后，將制備好的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌液分別稀釋至1x105cfu/mL，分別取150μL用L形玻璃棒均勻涂布瓊脂平板。以無菌操作將滅菌的牛津杯放置在涂菌后的平皿培養(yǎng)基上，輕加按壓使其與培養(yǎng)基之間沒有空隙，分別向牛津杯中滴加大蒜提取液0.1mL，將平皿置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑，取平均值，每株菌做3次重復(fù)。牛津杯試驗結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑大于20mm為非常敏感，15-20mm為高度敏感，10-15mm為中度敏感，小于10mm為低度敏感，0為不敏感。

1.2.4 MIC、MBC測定采用試管二倍稀釋法，向滅菌試管中加入MH營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基1mL，依次編號，在第1管中加入大蒜提取液1mL，混勻后吸取1mL至第2管，依次類推至第9管，棄去最后吸取的1mL，然后于每管中加入0.1mL濃度稀釋至1x108cfu/mL菌液，第10管加入菌液不含藥液作為陽性對照，第11管只加營養(yǎng)肉湯作為陰性對照，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌依次分別測定最小抑菌濃度。第1至9管大蒜提取液濃度分別400、200、100、50、25、12.5、6.3、3.11.6mg/mL，37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。當(dāng)陽性對照管有細(xì)菌生長（渾濁），陰性對照管無細(xì)菌生長（透明），試驗組以肉眼觀察無菌生長，無菌生長的最高稀釋度即為本大蒜提取液的MIC。從無菌生長的各試管中吸取培養(yǎng)物0.1mL接種到普通瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，以菌落數(shù)少于5個視為無細(xì)菌生長，以無細(xì)菌生長的藥物最低濃度作為本藥物的MBC。為減少誤差，本試驗重復(fù)3次，取2次結(jié)果相近的值作為最終值。

2 結(jié)果

2.1 抑菌試驗結(jié)果

表1 大蒜提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑（mm）

由表1可知，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌對大蒜提取物均為高度敏感，其中大蒜提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果優(yōu)于大腸桿菌。

2.2 最小抑菌濃度試驗結(jié)果

大蒜提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度分別見表2和表3。

表2 大蒜提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC

表3 大蒜提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MBC

由表2可知，本試驗所用大蒜提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC值分別為50mg/mL和25mg/mL；由表3可知，大蒜提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MBC值分別為50mg/mL和25mg/mL。

3 討論

大蒜提取液中有抗菌作用的主要有效成分是大蒜素，其主要成分為二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚等有機硫化合物。大蒜提取有效成分方法不同，其提取物主要成分也有差異，本試驗參考其他學(xué)者的試驗方法[4]，采用95%乙醇作為提取溶劑，通過浸提大蒜研磨液并濃縮制得大蒜提取液。結(jié)果表明，本試驗所得提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較好的抑菌效果，該結(jié)果與其他文獻報道的研究結(jié)果基本一致[5-7]，表明大蒜及其提取物可以應(yīng)用于臨床動物細(xì)菌感染性疾病的防治。