雙特異性單鏈抗體BiTE的研究進(jìn)展

周 沖， 于 峰， 韓邦興， 周 陽， 劉黎瓊， 施海峰

(1. 江蘇大學(xué) 生命科學(xué)研究院， 鎮(zhèn)江 212013； 2. 皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院 中藥研究與開發(fā)工程技術(shù)研究中心， 六安 237012； 3. 深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院血液科， 深圳 518052)

癌癥是嚴(yán)重威脅人類健康及社會發(fā)展的重大疾病。據(jù)中國2013年癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，中國新發(fā)病例368萬，占世界癌癥新發(fā)病例的四分之一，且發(fā)病率總體呈增長趨勢[1]。現(xiàn)有常規(guī)治療方案存在的非特異性、副作用大等問題推動了特異靶向治療癌癥的新型戰(zhàn)略發(fā)展。近年來，以BiTE為代表的一類具有顯著抗腫瘤效應(yīng)的雙特異抗體技術(shù)迅速發(fā)展。

BiTE又稱雙特異性T細(xì)胞接合器(bispecific T cell engager)，屬于雙特性單鏈抗體，可同時識別T細(xì)胞與表達(dá)特定的腫瘤表面抗原的靶細(xì)胞，幫助T細(xì)胞重定向到腫瘤病灶區(qū)[2]。人體自身大量存在的T細(xì)胞被激活可大量擴(kuò)增，產(chǎn)生強(qiáng)大而持久的細(xì)胞毒性反應(yīng)，且具有免疫記憶的潛力，因此BiTE利用T細(xì)胞治療癌癥的顯著優(yōu)勢可產(chǎn)生較好的治療效果[3]。

1 BiTE的結(jié)構(gòu)

BiTE本質(zhì)上是一個多肽鏈，結(jié)構(gòu)上由短的融合柔性接頭與兩個具有抗原特異性的單鏈可變片段(single chain variable fragment，scFv)組成(圖1)，大小約為55～60 ku，長度約為11 nm[4-6]。其中兩個scFv分別來自兩個單克隆抗體，一個靶向識別選定的腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigen，TAA)，另一個靶向識別T細(xì)胞表面的CD3ε，其中CD3ε是T細(xì)胞受體中CD3復(fù)合物亞基，是T細(xì)胞信號傳導(dǎo)的穩(wěn)定組成部分。小的無免疫原性的融合接頭連接一個重鏈與輕鏈組成scFv，同時串聯(lián)兩個scFv并允許它們能夠自由旋轉(zhuǎn)，一般由3個或更多個SGGGG柔性重復(fù)結(jié)構(gòu)組成(S代表絲氨酸，G代表甘氨酸)，甘氨酸分子量小、側(cè)鏈短可增加側(cè)鏈的柔韌性，絲氨酸較強(qiáng)的親水性可增加肽鏈的親水性[7-8]。優(yōu)化重復(fù)結(jié)構(gòu)的數(shù)目不僅幫助單鏈可變片段中的輕鏈與重鏈以正確構(gòu)象締合，并可通過影響兩個scFv之間的距離以促進(jìn)T細(xì)胞和靶細(xì)胞在免疫突觸中的最佳交互作用[9]。

圖1 BiTE的結(jié)構(gòu)與功能示意圖

A：BiTE結(jié)構(gòu)示意圖，BiTE(bispecific T cell engager)由抗T細(xì)胞CD3接頭肽與抗TAA的兩個特異性單鏈可變片段(single chain variable fragment，scFv)串聯(lián)組成；B：BiTE在腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞之間“橋梁“作用示意圖，BiTE特異性識別與橋接T細(xì)胞與靶細(xì)胞，形成T細(xì)胞-BiTE-靶細(xì)胞復(fù)合物

2 BiTE的作用機(jī)制

BiTE與其他抗體介導(dǎo)的免疫療法相似，選擇的靶標(biāo)抗原主要是腫瘤細(xì)胞膜上高表達(dá)但在正常組織上較低表達(dá)的蛋白[10]。該策略最大限度地減少了非預(yù)期的靶向腫瘤外反應(yīng)的可能性，同時優(yōu)化了對腫瘤的特異靶向性。目前BiTE的完整作用機(jī)制尚未完全清楚，但可以確定的是BiTE的兩個抗原識別結(jié)構(gòu)域橋接T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞，形成T細(xì)胞-BiTE-腫瘤細(xì)胞復(fù)合物，誘導(dǎo)細(xì)胞毒性免疫突觸形成，促進(jìn)T細(xì)胞活化和細(xì)胞毒性分子、細(xì)胞因子的產(chǎn)生，進(jìn)而使T細(xì)胞免疫激活并裂解靶細(xì)胞(圖2)[11]。

BiTE的作用機(jī)制以抗原依賴性為基礎(chǔ)，且具有雙重結(jié)合依賴性，即BiTE必須同時結(jié)合T細(xì)胞與表達(dá)相關(guān)抗原的腫瘤細(xì)胞，才能產(chǎn)生T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，在BiTE單臂結(jié)合T細(xì)胞而無靶細(xì)胞存在或靶細(xì)胞不表達(dá)選定靶向抗原的情況下，這種作用機(jī)制不發(fā)生。研究表明，當(dāng)BiTE同時結(jié)合T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞時，可誘導(dǎo)T細(xì)胞的活化標(biāo)志物CD69與CD25以及細(xì)胞因子的表達(dá)上調(diào)，包括IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6和IL-10等，T細(xì)胞被激活而迅速增殖，效應(yīng)細(xì)胞總數(shù)增加，殺傷效率進(jìn)一步增強(qiáng)[12-13]。而BiTE單側(cè)結(jié)合CD3并不能激活T細(xì)胞或者產(chǎn)生這種誘導(dǎo)能力。這種抗原依賴式的效應(yīng)機(jī)制規(guī)避了預(yù)期外的T細(xì)胞活化與非特異性毒性產(chǎn)生，預(yù)示BiTE靶向抗原的嚴(yán)格特異性優(yōu)點。

圖2 BiTE作用機(jī)制示意圖

BiTE通過兩個scFv在腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞之間形成免疫突觸復(fù)合體；免疫突觸包括由PKCθ(protein kinase C θ，蛋白激酶θ)、Lck(lymphocyte-specific protein tyrosine kinase, 淋巴細(xì)胞特異性蛋白酪氨酸激酶)等組成的中心超分子活化簇以及由黏附分子LFA1(lymphocyte function-associated antigen-1，淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1激酶)等組成的外周超分子激活簇；T細(xì)胞活化、增殖，通過胞吐顆粒作用于靶細(xì)胞；在Ca2+存在情況下，穿孔素在靶細(xì)胞膜上形成跨膜通道，介導(dǎo)T細(xì)胞釋放的顆粒酶B進(jìn)入靶細(xì)胞，誘導(dǎo)靶細(xì)胞發(fā)生死亡級聯(lián)反應(yīng)，靶細(xì)胞裂解

BiTE誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性免疫突觸的結(jié)構(gòu)在組成、尺寸、亞結(jié)構(gòu)與溶解突觸的空間排列上與經(jīng)典的細(xì)胞毒性T細(xì)胞識別誘導(dǎo)的突觸基本相同[14]。免疫突觸由含有重要信號分子的“中心超分子活化簇”(cSMAC)組成，而cSMAC被稱作“外周超分子激活簇”(pSMAC)的細(xì)胞黏附分子作用域所包圍。在BiTE誘導(dǎo)下，CD8+T細(xì)胞和表達(dá)選定TAA的靶細(xì)胞之間形成cSMAC與pSMAC，包括穿孔素(perforin)、PKC θ(protein kinase C θ)、Lck(lymphocyte-specific protein tyrosine kinase)、CD3的中心定位以及LFA1(lymphocyte function-associated antigen-1)的外周定位[15]。這種免疫突觸的形成主要與BiTE介導(dǎo)的T細(xì)胞脫粒有關(guān)，其形成頻率受TAA表達(dá)水平和BiTE濃度影響。這種免疫突觸不依賴于靶細(xì)胞上的MHC I類分子，例如靶向EpCAM的BiTE對于高表達(dá)EpCAM但MHC I分子缺失的K562腫瘤細(xì)胞亦可介導(dǎo)形成免疫突觸并發(fā)生細(xì)胞毒性作用。

BiTE主要結(jié)合CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞、記憶CD4+輔助T細(xì)胞和TREG細(xì)胞，天然T細(xì)胞需經(jīng)過CD3/CD28處理才能產(chǎn)生細(xì)胞毒性[16]。BiTE結(jié)合的細(xì)胞毒性T細(xì)胞可通過胞吐釋放顆粒作用于靶細(xì)胞，包括穿孔素與顆粒酶B(granzyme B)。穿孔素以單體形式被分泌至免疫突觸中，通過鈣依賴的C2結(jié)構(gòu)域快速結(jié)合靶細(xì)胞膜，在鈣離子存在下，多個穿孔素單體(約24個)聚集在靶細(xì)胞膜上并形成直徑約18 nm的跨膜孔道，靶細(xì)胞膜發(fā)生去極化，同時顆粒酶B被轉(zhuǎn)運至靶細(xì)胞內(nèi)，并激活胞內(nèi)凋亡級聯(lián)反應(yīng)(如胱天蛋白酶3/7)，切割靶細(xì)胞內(nèi)多種死亡底物，包括DNA斷裂因子(DFF)、多聚ADP核糖聚合酶(PARP)、核纖層蛋白等，最終致使腫瘤細(xì)胞死亡[17-19]。使用鈣螯合劑EGTA可保護(hù)表達(dá)抗原的靶細(xì)胞免受BiTE介導(dǎo)的細(xì)胞毒性證明了穿孔素機(jī)制的參與。另外尚未有研究表明FasL-Fas受體系統(tǒng)參與BiTE介導(dǎo)下的殺傷作用，盡管其在正常細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮重要作用。

此外，BiTE賦予結(jié)合的T細(xì)胞抗原特異性，這個過程不依賴于T細(xì)胞本身的抗原特異性以及共刺激信號，這樣可克服腫瘤免疫逃避機(jī)制中MHC I類分子和共刺激分子的喪失或下調(diào)、以及肽抗原加工和表面遞送的缺陷[20]。目前BiTE不需要共刺激即可誘導(dǎo)T細(xì)胞毒性產(chǎn)生的原因尚未清楚，有研究者認(rèn)為較少刺激即可活化的記憶T細(xì)胞是主要效應(yīng)細(xì)胞。印證這點的是BiTE抗體 Blinatumomab可誘導(dǎo)CD8+/CD45RO+記憶T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，但是對CD8+/CD45RA+無作用[21]。

3 BiTE的臨床應(yīng)用

目前多種靶向不同的腫瘤抗原BiTE抗體已經(jīng)被報道有較高的抗腫瘤活性，包括CD19、EpCAM、HER2、EGFR、CEA、CD33、EphA2和MCSP(或HMW-MAA)等[22-25]。由于BiTE抗體分子量小于一般抗體類藥物，所以BiTE抗體具有較好的組織滲透性，在各種異種移植瘤模型中顯示較高的抗腫瘤活性，且已在臨床上運用(表1)。

表1 BiTE的臨床運用

3.1 Blinatumomab

Blinatumomab(MT103)是靶向CD19/CD3的BiTE，對B細(xì)胞衍生的急性淋巴白血病(ALL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)顯示出一定療效與安全性[26]。Blinatumomab在2014年12月獲得FDA批準(zhǔn)，成為第一個被批準(zhǔn)用于治療ALL與NHL的BiTE。有研究表明抗CD19/CD3雙特異抗體的BiTE優(yōu)于其他基于T細(xì)胞介導(dǎo)裂解腫瘤細(xì)胞的抗體結(jié)構(gòu)形式，如雙抗體(diabody)，可能是BiTE的兩個scFv之間的相對位置與距離促進(jìn)了T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的緊密接觸[27]。

3.2 MT-110

MT-110是靶向EpCAM/CD3的BiTE，用于上皮起源的實體瘤，包括乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和卵巢腫瘤。臨床前數(shù)據(jù)顯示在NOD/SCID異種移植結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的小鼠模型中表現(xiàn)出抑瘤活性[28]。體外數(shù)據(jù)表明MT110可抑制原發(fā)性胰腺癌細(xì)胞的生長。目前正在進(jìn)行臨床I期研究階段，以評估MT110在實體瘤患者中的安全性和耐受性問題。

3.3 MT-111

MT111靶向癌胚抗原CEA，是第三個進(jìn)入臨床實驗的BiTE[29]。CEA是一種免疫球蛋白超家族糖蛋白，其表達(dá)在多種實體瘤上以及成年人的胃腸道、汗腺和前列腺上皮等多部位。臨床前數(shù)據(jù)顯示注射MT111與人T細(xì)胞能夠顯著抑制SCID小鼠模型中異種移植的結(jié)腸癌。目前MT111進(jìn)入針對胃腸道腺癌的I期臨床試驗。

4 BiTE的創(chuàng)新性運用

BiTE的分子量相對較小，因此具有較強(qiáng)的組織滲透力，可提高腫瘤細(xì)胞的外顯率，但缺乏Fc段，易在體內(nèi)被快速消除，血液半衰期較短[30]。臨床上檢測BiTE在人體內(nèi)半衰期約為1.25 h，因此需要推注泵或者一天內(nèi)多次輸注以維持血藥濃度[31]。為了解決這一問題，有研究者創(chuàng)新性地將BiTE與其他腫瘤治療策略組合運用。

4.1 痘病毒載體

使用基因重組技術(shù)，構(gòu)建表達(dá)分泌型BiTE的溶瘤痘病毒(VV)，可使痘病毒溶瘤的同時，通過分泌的BiTE募集體內(nèi)T細(xì)胞到腫瘤部位并進(jìn)行其介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞殺傷。例如Yu等構(gòu)建了分泌靶向EphA2/CD3抗原的BiTE的痘病毒，發(fā)現(xiàn)分泌表達(dá)的BiTE增強(qiáng)了痘病毒殺傷活性[32]。這種使用痘病毒作為載體并表達(dá)BiTE的重組痘病毒構(gòu)建方式，結(jié)合溶瘤劑和BiTE作用的策略，可以延長BiTE在體內(nèi)的存活時間，促進(jìn)溶瘤劑的功效，具有廣闊的發(fā)展前景。

4.2 Engager T 細(xì)胞

Engager T細(xì)胞是一種新興的基因工程化T細(xì)胞。通過慢病毒或者逆轉(zhuǎn)錄病毒等手段，將表達(dá)BiTE的模塊轉(zhuǎn)入T細(xì)胞中，使其分泌表達(dá)BiTE。已報道的Engager T 細(xì)胞靶點包括CD19、EphA2等。例如Bonifant等構(gòu)建了可以分泌靶向CD123 BiTE的CD123-ENG T細(xì)胞，臨床前數(shù)據(jù)表明其以抗原依賴性方式識別原發(fā)性急性骨髓性白血病(AML)細(xì)胞，并可幫助旁觀者T細(xì)胞重定向至AML細(xì)胞，在AML的異種移植小鼠模型中顯示了抑制腫瘤的效力[33]。

Engager T細(xì)胞結(jié)合了BiTE和基因工程化T細(xì)胞的優(yōu)勢，既能通過分泌的BiTE，使體內(nèi)常駐T細(xì)胞重定向表達(dá)相關(guān)抗原的腫瘤細(xì)胞，又能通過被靶抗原激活從而釋放免疫刺激因子且促進(jìn)自我擴(kuò)增，從而擴(kuò)大免疫應(yīng)答的效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量[34]。因此，利用Engager T細(xì)胞靶向腫瘤，是一種具有優(yōu)勢的免疫治療策略。

5 展望

皮摩爾濃度的BiTE能募集T細(xì)胞，并誘導(dǎo)T細(xì)胞在靶抗原存在下分泌細(xì)胞因子，以極高的效力殺傷腫瘤細(xì)胞，其雙重結(jié)合的特異性以及強(qiáng)大抗腫瘤活性說明BiTE是一類具有廣闊發(fā)展前景的新型靶向治療策略。此外BiTE已被證明可以重新激活免疫抑制微環(huán)境中的T細(xì)胞，還可以轉(zhuǎn)變TREG細(xì)胞由免疫抑制作用到靶向腫瘤的毒性作用[35]。BiTE自1995年第一次出現(xiàn)，到2014年正式被FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床以來，持續(xù)發(fā)展，但BiTE還需根據(jù)臨床數(shù)據(jù)與現(xiàn)有存在問題進(jìn)行改進(jìn)以提高治療選定疾病的微環(huán)境中效力，克服包括短的血清半衰期、腫瘤靶抗原丟失的潛在可能性、免疫抑制受體的抑制作用(如PD1、CTL-4)，以及現(xiàn)有臨床觀察到的毒性或副作用等問題[36]?？傮w來說，BiTE所代表的新型高效率與靶向性的免疫療法，未來將在免疫治療策略中占據(jù)舉足輕重的地位。