高壓均質(zhì)法提取藥用真菌多糖的研究

龔勁松， 袁 峰， 袁兵兵， 陳 露， 陸震鳴， 王英燕， 趙伏梅， 徐國華， 史勁松， 許正宏

(1. 江南大學(xué) 藥學(xué)院 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室， 無錫 214122； 2. 江蘇神華藥業(yè)有限公司 江蘇省藥用真菌生物工程技術(shù)研究中心， 淮安 211600)

藥用真菌可產(chǎn)生數(shù)量眾多的活性代謝產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)、多糖、氨基酸、維生素、生物堿、萜類化合物、甾醇、酚類、酶、核苷、有機(jī)酸等，且很多具有抗癌、降血糖、降血脂、抗氧化等多種功效。猴頭菌(Hericeumerinaceus)是一種珍貴的藥用真菌，又稱猴頭菇、猴菇、刺猬菌等，屬于擔(dān)子綱[1]。猴頭菌中含有豐富的葡萄糖、海藻糖、甘露醇等可溶性糖，同時(shí)其菌體中也存在種類多樣的各種氨基酸和芳香族化合物，這些物質(zhì)造就了該藥用真菌所具備的得天獨(dú)厚的功效與風(fēng)味[2-4]。傳統(tǒng)中醫(yī)記載，猴頭菌具有性平味甘的特征，在調(diào)理五臟六腑、改善消化道功能、營養(yǎng)保健等方面具有良好的功效，截至目前已被成功應(yīng)用于治療胃潰瘍、消化不良、免疫低下、神經(jīng)衰弱等領(lǐng)域[5-6]。

隨著技術(shù)的進(jìn)步，人們對(duì)猴頭菌H.erinaceus藥用價(jià)值的認(rèn)識(shí)也逐步深入，猴頭菌的抗衰老、抗癌、抗消化紊亂、神經(jīng)保護(hù)等作用逐漸得到證實(shí)與報(bào)道，猴頭菌內(nèi)的各有效活性組分也得到了針對(duì)性研究[7-8]。圍繞猴頭菌體內(nèi)的重要組分多糖，目前已制備得到多種具有代表性的糖類組分。隨著目前社會(huì)老齡化來臨，老年人口數(shù)量在逐年增多，而患阿爾茲海默癥的老年人也在快速增加。研究發(fā)現(xiàn)猴頭菌在預(yù)防和治療老年癡呆方面具有良好的應(yīng)用價(jià)值，目前已分離獲得多種能用于改善或治療阿爾茲海默癥的猴頭菌相關(guān)組分。猴頭菌在醫(yī)藥領(lǐng)域的價(jià)值總結(jié)起來主要包括如下方面：1)抗炎及治療潰瘍；2)提升肌體對(duì)缺氧環(huán)境的耐受能力；3)改善心肌血液流量，促進(jìn)機(jī)體血液循環(huán)；4)緩解疲勞；5)降血糖降血脂降血壓；6)保肝護(hù)肝；7)抗腫瘤；8)抗氧化、緩解衰老等[9-10]。

截至目前已報(bào)道的猴頭菌H.erinaceus活性成分眾多，其中多糖、萜類、酚類、甾醇類、脂肪酸等物質(zhì)被廣泛作為研究對(duì)象，而多糖是猴頭菌研究工作中的重要目標(biāo)[11-12]。分析表明，猴頭菌H.erinaceus多糖成分以葡萄糖、甘露糖以及半乳糖為主，其中葡萄糖含量最高，它是以不同鍵型連接而成的葡聚糖，其中主鏈由β(1→3)鍵所連接，支鏈由β(1→6)鍵連接而成，其相對(duì)分子量約為40 ku[13]。早期有研究報(bào)道認(rèn)定猴頭菌H.erinaceus的子實(shí)體多糖主要組分是1∶1的葡萄糖和半乳糖，而菌株品種和檢測(cè)方法的不同也可能導(dǎo)致最終的猴頭菌多糖組分存在差異[14]。上海農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院張勁松團(tuán)隊(duì)采用GC法分別對(duì)猴頭菌H.erinaceus子實(shí)體和菌絲體多糖進(jìn)行了系統(tǒng)檢測(cè)分析。結(jié)果顯示，子實(shí)體多糖樣品中的單糖組分豐富，主要包括有葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖，而菌絲體所提取的多糖樣品中的單糖組分與子實(shí)體則表現(xiàn)出一定差異，除葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖外，還檢測(cè)到了顯著的木糖存在[15]。

真菌多糖是一類重要的生物活性物質(zhì)，目前相關(guān)研究主要集中于真菌多糖的分離提取、含量分析檢測(cè)、物質(zhì)結(jié)構(gòu)解析、藥理活性評(píng)價(jià)等領(lǐng)域[16]。然而，已報(bào)道的真菌多糖仍然多為雜多糖，深入研究具有一定困難，另外，真菌的生長環(huán)境、提取制備工藝的不同也會(huì)影響到多糖的結(jié)構(gòu)及其生物活性。目前盡管已有多種真菌多糖應(yīng)用于臨床，但質(zhì)量及品質(zhì)不易控制，藥效重復(fù)性偏低，與國際規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)有一定差距，嚴(yán)重限制了真菌多糖在醫(yī)藥行業(yè)的廣泛應(yīng)用[17]。開展真菌多糖的提取工藝研究，是進(jìn)行產(chǎn)品開發(fā)的基礎(chǔ)。猴頭菌及其多糖在醫(yī)藥、生物、保健、食品、美容等工業(yè)中具有極具潛力的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景，市場(chǎng)需求也逐年增加，因此作者對(duì)猴頭菌多糖的分離提取工藝進(jìn)行了探索性研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌種來源：猴頭菌H.erinaceus來自于江蘇神華藥業(yè)有限公司(江蘇金湖)，并由本實(shí)驗(yàn)室于4℃保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基及組分

1)PDA斜面培養(yǎng)基(g/L)：土豆 200，葡萄糖 20，瓊脂 20，自然pH值；

2)液體種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 20，酵母粉 10，花生餅粉 10，KH2PO43，MgSO41.5，pH 6.0；

3)發(fā)酵培養(yǎng)基配方與種子培養(yǎng)基相同。

1.1.3 化學(xué)試劑

實(shí)驗(yàn)主要試劑及來源見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)主要試劑及來源

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

本實(shí)驗(yàn)涉及的相關(guān)儀器如表2所示。

表2 主要儀器設(shè)備

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 液體深層發(fā)酵制備菌絲體

本實(shí)驗(yàn)采用5 L發(fā)酵罐進(jìn)行猴頭菌H.erinaceus的液體深層發(fā)酵，以制備獲得其菌絲體。H.erinaceus發(fā)酵培養(yǎng)的接種量按10%進(jìn)行，通氣量為1V/V·min，置于28℃及200 r/min發(fā)酵4 d。為收集獲得猴頭菌H.erinaceus菌絲體，將按照以上方式培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液在8000 r/min條件下離心10 min，并計(jì)算其含水量。

1.3.2 3種提取方法所得猴頭多糖的比較

1)高壓均質(zhì)法。準(zhǔn)確稱量20 g猴頭菌絲體加入300 mL ddH2O中，采用Panda Plus 2000高壓均質(zhì)機(jī)在最優(yōu)條件下進(jìn)行均質(zhì)破碎，操作壓力設(shè)定為80 MPa，均質(zhì)次數(shù)設(shè)置為3次，通過循環(huán)冷凝水進(jìn)行溫度控制；高壓均質(zhì)結(jié)束后，在冷凍離心機(jī)中8000 r/min的離心條件下離心10 min，將上清液在50℃條件下減壓濃縮后，按照體積比1∶3加入無水酒精，在4℃過夜處理，沉淀在凍干機(jī)上經(jīng)冷凍干燥收獲猴頭菌H.erinaceus胞內(nèi)多糖。

2)超聲提取法。準(zhǔn)確稱量20 g猴頭菌絲體加入300 mL ddH2O中，在冰浴條件下進(jìn)行細(xì)胞破碎。儀器：新芝JY92-II超聲破碎儀，功率200 W，操作周期40 min(其中運(yùn)行10 s停5 s)。經(jīng)鏡檢確認(rèn)細(xì)胞充分破裂后，在離心機(jī)中設(shè)置8000 r/min離心10 min，濃縮液按照體積比1∶3加入無水酒精，于4℃醇沉過夜，再經(jīng)凍干處理后收集多糖樣品。

1.3.3H.erinaceus胞內(nèi)多糖相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

1)總糖、蛋白和還原糖含量。①總糖含量。按照文獻(xiàn)報(bào)道的苯酚-硫酸法[18]測(cè)定H.erinaceus多糖經(jīng)分步醇沉所得各組分的總糖含量。具體實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：

對(duì)照品溶液的制備：在分析天平上精確稱取適量無水葡萄糖樣品，經(jīng)105℃烘箱干燥至恒重，配制成濃度為1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

供試品溶液的制備：精確稱取適量H.erinaceus多糖樣品，加ddH2O充分溶解配制成0.5 mg/mL的樣品溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：將上述制備獲得的標(biāo)準(zhǔn)溶液按照以下體積準(zhǔn)確吸取添加至具塞的玻璃試管中：0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8和2.0 mL，將其體積用ddH2O補(bǔ)齊至2.0 mL，繼而在該玻璃試管中加入1.0 mL、6%的苯酚溶液，待搖勻后再快速加入5 mL濃硫酸，在室溫條件下反應(yīng)30 min，將樣品再次充分混合均勻，以不加入葡萄糖的0號(hào)玻璃試管作為空白對(duì)照，通過分光光度計(jì)檢測(cè)各個(gè)樣品在490 nm處的吸收值。最后根據(jù)葡萄糖濃度及與檢測(cè)得到的吸收值計(jì)算獲得回歸方程。

樣品的檢測(cè)：取待檢測(cè)樣品配成的溶液2.0 mL，在分光光度計(jì)上測(cè)定該樣品在490 nm處吸收值，并根據(jù)回歸方程可計(jì)算出該樣品總糖含量。

②蛋白含量。采用上海生工生物工程有限公司提供的Folin-酚試劑盒檢測(cè)猴頭菌H.erinaceus胞內(nèi)多糖各組分的蛋白含量。

根據(jù)敏感性分析結(jié)果，選取油水界面、孔隙度下限值、主變程3個(gè)主要敏感性因素開展該次不確定性分析，采用蒙特卡洛輔以拉丁超立方和正交陣列采樣方式，設(shè)置實(shí)現(xiàn)次數(shù)81次。結(jié)果表明，J油田儲(chǔ)量分布范圍：P10為1901.87萬m3、P50為2114.64萬m3、P90為2372.11萬m3(圖7)。P50是儲(chǔ)量分布中頻率最高值即最可能值，推薦其作為開發(fā)方案編制的基礎(chǔ)，而針對(duì)P10設(shè)置風(fēng)險(xiǎn)方案，針對(duì)P90設(shè)置潛力方案。

③還原糖含量。胞內(nèi)多糖樣品的還原糖含量采用DNS法進(jìn)行測(cè)定[19]。

2)單糖組成。本研究采用氣相色譜儀(GC)進(jìn)行猴頭菌H.erinaceus胞內(nèi)多糖樣品的單糖組分分析。樣品中多糖的水解操作步驟如下，精確稱量20 mg猴頭菌H.erinaceus多糖粉末置于專用水解管中，在管中添加2 mL 1 mol/L的硫酸溶液，將管口完全封閉，于100℃沸水中充分水解4 h，水解液通過BaCO3進(jìn)行中和，經(jīng)過濾去除雜質(zhì)及沉淀，將樣品的濾液?jiǎn)为?dú)回收，置于凍干機(jī)上，低溫條件下真空干燥，獲得游離的單糖組分。

衍生化過程操作步驟如下，準(zhǔn)確稱取干燥所得單糖樣品粉末適量，分別在樣品中加入10 mg鹽酸羥胺、2 mg肌醇、0.5 mL吡啶，將反應(yīng)體系置于90℃的恒溫?zé)崴≈?，保?0 min；待其冷卻后再添加0.5 mL乙酸酐，于90℃繼續(xù)溫浴30 min，樣品冷卻后可通過GC進(jìn)行單糖含量分析。GC的操作條件參考文獻(xiàn)[20]。

3)紅外光譜分析。準(zhǔn)確稱量猴頭菌H.erinaceus胞內(nèi)多糖各組分樣品1～2 mg，采用KBr壓片法對(duì)各多糖樣品進(jìn)行紅外光譜(FT-IR spectra)檢測(cè)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同方法所提取H. erinaceus胞內(nèi)多糖的得率

本研究首先探究了動(dòng)態(tài)高壓均質(zhì)法的提取條件，并采用最優(yōu)提取條件下的高壓均質(zhì)法提取猴頭菌H.erinaceus胞內(nèi)多糖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用動(dòng)態(tài)高壓均質(zhì)法、超聲提取法和熱水提取法3種不同方法所得猴頭菌胞內(nèi)多糖的得率分別為16.42%、5.12%和4.81%(表3)。由結(jié)果可以看出，采用高壓均質(zhì)法所提取的猴頭菌胞內(nèi)多糖得率最高，相比傳統(tǒng)的超聲提取法和熱水提取法得率高出約3倍。分析其原因，可能由于高壓均質(zhì)過程會(huì)產(chǎn)生多種機(jī)械和物理效應(yīng)，包括剪切力、撞擊力以及空化效應(yīng)等，使得猴頭菌H.erinaceus細(xì)胞內(nèi)多糖能快速充分釋放至胞外，從而顯著提升了其多糖的提取得率。

另外，經(jīng)不同提取方法所制備獲得的猴頭菌H.erinaceus胞內(nèi)多糖均呈現(xiàn)粉末狀，顏色也具有一定差異，其中，采用動(dòng)態(tài)高壓均質(zhì)法及超聲法所得的多糖顏色相比熱水法較淺，究其原因，可能為熱水的高溫使多糖樣品分子間發(fā)生了美拉德反應(yīng)，導(dǎo)致了樣品顏色變深。

表3 采用不同方法提取猴頭胞內(nèi)多糖得率情況

2.2 胞內(nèi)多糖化學(xué)組成及分子性質(zhì)

2.2.1 總糖、蛋白、還原糖含量

由表4可知，動(dòng)態(tài)高壓均質(zhì)法所得猴頭菌H.erinaceus多糖的總糖為57.11%，與超聲提取法和熱水提取法基本接近，后兩者分別為58.45%及60.23%，其中傳統(tǒng)的熱水法所得多糖中總糖含量為最高；另一方面，高壓均質(zhì)提取法所得蛋白含量則最高，熱水提取法最低。分析其原因，可能歸于高溫使布朗運(yùn)動(dòng)加劇，分子顆粒運(yùn)動(dòng)更加激烈，分子量較高的多糖在此條件下易于更多的擴(kuò)散至水中，最終提升了樣品中總糖含量，與此同時(shí)，溫度升高也會(huì)使得蛋白發(fā)生降解，因此檢測(cè)到的蛋白含量相應(yīng)偏低；另外，高壓均質(zhì)提取法所得還原糖含量也為最高，可能歸于物理操作的剪切力使得樣品部分糖苷鍵發(fā)生斷裂，猴頭菌H.erinaceus多糖樣品中的還原糖含量因此而相應(yīng)獲得提升。

表4 不同方法提取猴頭菌胞內(nèi)多糖的總糖、蛋白和還原糖相對(duì)含量

2.2.2 分子量分布

表5為高壓均質(zhì)、超聲和熱水提取3種不同方法所提取的猴頭菌H.erinaceus胞內(nèi)多糖的分子量分布。對(duì)3種不同提取方法所得多糖分子量的分析結(jié)果表明，熱水提取法所得多糖分子量最高，而高壓均質(zhì)法和超聲法所提取的多糖分子量相對(duì)偏小，這反映出高壓均質(zhì)法和超聲法在操作過程中所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力可能導(dǎo)致多糖部分糖苷鍵斷裂，致使猴頭菌H.erinaceus胞內(nèi)多糖的最終分子量偏低，不過其工藝操作周期較短，因而這兩種方法所得產(chǎn)品的分子量降低幅度相比熱水提取法差異也并不明顯。

表5 3種提取方法所得猴頭菌胞內(nèi)多糖的分子量分布情況

Mn、Mp和Mw分別代表數(shù)均、峰位和重均分子量

2.2.3 單糖組成

圖1所示為3種不同方法所提取猴頭菌H.erinaceus胞內(nèi)多糖的單糖組成，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明樣品中包括巖藻糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和鼠李糖，但是其含量分布并不一致，這可能歸因于多糖種類不同所導(dǎo)致的差異。此外，從圖1中也可以看出，半乳糖是猴頭菌多糖樣品的單糖組成中含量最高的組分，而其中阿拉伯糖和葡萄糖含量則次之。

2.2.4 紅外光譜分析

如圖2所示為采用高壓均質(zhì)、超聲和熱水提取3種不同方法提取所得猴頭菌H.erinaceus胞內(nèi)多糖的紅外光譜圖。不同類型的官能團(tuán)在紅外光譜圖中特征峰的出峰位置和形狀相應(yīng)會(huì)有所差異。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)紅外分析結(jié)果來看，采用不同提取方法所得猴頭多糖樣品的出峰位置和峰形基本一致。如圖2，在3390 cm-1處出現(xiàn)了較顯著的吸收峰，為羥基的O-H伸縮振動(dòng)吸收峰；在2930 cm-1處出現(xiàn)的較弱吸收峰則是烷基的C-H伸縮振動(dòng)吸收峰；在1640 cm-1處出現(xiàn)的較強(qiáng)吸收峰則是羧基的C=O非對(duì)稱伸縮振動(dòng)，根據(jù)結(jié)果分析來看，該樣品中可能具有糖醛酸結(jié)構(gòu)。

圖1 采用不同提取方法所得猴頭胞內(nèi)多糖的單糖組成分析

圖2 采用3種不同方法所提取的猴頭胞內(nèi)多糖的紅外光譜圖

3 結(jié)論

1)本實(shí)驗(yàn)綜合比較了高壓均質(zhì)提取法、熱水提取法、超聲提取法這3種不同方法所提取猴頭菌胞內(nèi)多糖的提取得率以及各項(xiàng)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高壓均質(zhì)法的提取效率較高，猴頭菌胞內(nèi)多糖的提取得率可達(dá)到16.42%，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)方法。

2)3種不同方法提取所得猴頭菌胞內(nèi)多糖的總糖含量基本接近，高壓均質(zhì)提取法含量為57.11%，而熱水提取法相對(duì)較高，為60.23%；蛋白含量為26.34%、15.45%和10.12%；還原糖含量分別為3.71%、2.93%及2.44%；多糖的分子量分布方面，熱水提取法多糖分子量略高于高壓均質(zhì)法和超聲提取法。進(jìn)一步的紅外光譜分析結(jié)果顯示，不同方法所得多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)基本一致。