電針補(bǔ)腎益精法對(duì)圍絕經(jīng)期血管性癡呆大鼠腦組織SOD、MDA含量的影響

宋 揚(yáng) 徐天舒

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合鼓樓臨床學(xué)院，江蘇南京210023；2.南京鼓樓醫(yī)院，江蘇南京210008）

血管性癡呆（Vascular Dementia，VD）主要是由于出血或缺血性卒中導(dǎo)致人體行為和認(rèn)知等腦區(qū)低灌注從而出現(xiàn)的認(rèn)知功能障礙。已有研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)是女性血脂異常的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，絕經(jīng)后總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇均較絕經(jīng)前明顯升高[1]，且隨著絕經(jīng)年限的延長(zhǎng)，升高越顯著，由此引發(fā)的腦血管疾病、VD成為圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后中老年女性需關(guān)注的問(wèn)題。隨著醫(yī)療條件和技術(shù)的進(jìn)步，腦血管病的死亡率在逐年下降，但因腦血管病造成的各類癡呆發(fā)生率卻在升高，因此對(duì)圍絕經(jīng)期VD的研究具有現(xiàn)實(shí)和迫切的社會(huì)意義。大量研究表明，電針治療VD有較確切的療效[2-4]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，電針補(bǔ)腎益精法對(duì)圍絕經(jīng)期大鼠有腦保護(hù)的作用[5]。為此，本研究采用電針治療圍絕經(jīng)期VD模型大鼠，觀察其空間學(xué)習(xí)記憶能力，并檢測(cè)腦組織SOD、MDA水平，旨在研究電針對(duì)圍絕經(jīng)期VD的治療作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 11～15月齡清潔級(jí)SD雌性大鼠，體重370g左右，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0017，飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)在南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心屏障環(huán)境[SYXK（蘇）2014-0052]。

1.2 主要儀器與試劑 低溫高速離心機(jī)，分光光 度 計(jì)，Labsystems Finnpipette 100μL單 道 移 液器，Thermo 50μL 8道移液器，HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司），MCAO栓線（北京沙東生物技術(shù)有限公司，型號(hào)為2432-50 AAAA），華佗牌SDZ-V型電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠），0.25mm×13mm華佗牌一次性針灸針。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模與分組 造模大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后連續(xù)5d行陰道分泌物采樣涂片，經(jīng)HE染色后光鏡下觀察脫落細(xì)胞。鏡下連續(xù)5d呈現(xiàn)無(wú)規(guī)律動(dòng)情周期變化則可確定為圍絕經(jīng)期大鼠。用3.5%水合氯醛按1mL/100g體重將圍絕經(jīng)期大鼠腹腔麻醉后，仰臥固定；頸正中切口，分離雙頸總動(dòng)脈；用“0”號(hào)線結(jié)扎雙頸總動(dòng)脈血流10min，再灌注10min，共間歇阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈血流3次，每次間隔10min；術(shù)后縫合切口，籠內(nèi)飼養(yǎng)。假手術(shù)組大鼠僅分離雙頸總動(dòng)脈不結(jié)扎。術(shù)后7d，對(duì)造模大鼠進(jìn)行Morris水迷宮試驗(yàn)以篩選入組大鼠。分別記錄每只大鼠的逃避潛伏期，計(jì)算假手術(shù)組逃避潛伏期的平均值（X），標(biāo)準(zhǔn)差（Y），以“X+2Y”為標(biāo)準(zhǔn)值[2]，如逃避潛伏期大于“X+2Y”則認(rèn)為VD模型造模成功。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組和電針組，每組10只，假手術(shù)組取10只。

2.2 干預(yù)方法 電針組：固定大鼠，選取“關(guān)元”及雙側(cè)“三陰交”（大鼠穴位定位參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》），針刺得氣后，連接電子針療儀，以肢體微微抖動(dòng)為度，連續(xù)波，頻率為2Hz，每次20min，每日1次，共治療20次。模型組、假手術(shù)組：每日同時(shí)間點(diǎn)固定20min。

2.3 行為學(xué)檢測(cè) 治療結(jié)束后各組大鼠行Morris水迷宮試驗(yàn)檢測(cè)其定位航行能力。每日將大鼠面向池壁分別從4個(gè)入水點(diǎn)放入水中若干次，記錄其尋找到隱藏在水面下平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期（escape latency）。記錄每只大鼠連續(xù)5d的逃避潛伏期平均值，計(jì)算每日每組大鼠潛伏期的平均值，評(píng)價(jià)各組動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶的獲得能力。

2.4 腦組織SOD、MDA含量測(cè)定 行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，各組鼠斷頭處死，2min內(nèi)取出大鼠腦組織，迅速置于冰盤上分離腦組織，棄取嗅球和小腦，與4℃預(yù)冷的生理鹽水一起倒入勻漿管中進(jìn)行勻漿，充分研碎，使組織勻漿化，制成10%的腦組織勻漿，3000r/min離心10min，留上清液，4℃保存待測(cè)。按照SOD、MDA試劑盒說(shuō)明書，用光電比色法測(cè)定大鼠腦組織中SOD活性、MDA含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，方差齊時(shí)采用t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用t′檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠Morris水迷宮定位航行逃避潛伏期比較 結(jié)果見(jiàn)表1。隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)，各組大鼠在Morris水迷宮試驗(yàn)中的上臺(tái)前游泳時(shí)間都呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。與同期假手術(shù)組比較，模型組大鼠各時(shí)期的逃避潛伏期均明顯延長(zhǎng)（P＜0.05），說(shuō)明VD模型建立成功，模型大鼠存在明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙。與模型組比較，電針組大鼠的逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.05），說(shuō)明經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的治療后，“補(bǔ)腎益精”電針療法可明顯改善圍絕經(jīng)期VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

3.2 各組大鼠腦組織SOD、MDA水平比較 結(jié)果見(jiàn)表2，說(shuō)明“補(bǔ)腎益精”電針?lè)捎行Ц纳茋^經(jīng)期VD模型大鼠腦組織SOD、MDA水平。

4 討論

VD發(fā)病多見(jiàn)于中老年人群，中國(guó)65歲以上人群中VD患病率為1.1%，約占癡呆總患病率的30%[6]。圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后婦女血脂異常率高[7]，并隨著絕經(jīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，升高更顯著，由此損傷心腦血管造成缺血缺氧腦損害機(jī)率不斷升高。

表1 各組大鼠連續(xù)5d逃避潛伏期比較（±s） s

表1 各組大鼠連續(xù)5d逃避潛伏期比較（±s） s

注：△與假手術(shù)組比較，P＜0.05；#與模型組比較，P＜0.05。

假手術(shù)組 10 82.4±1.43 64.7±2.23 52.6±1.78 39.0±1.15 23.5±1.43模型組 10 96.9±1.52△ 89.3±1.49△ 77.4±1.35△ 69.2±1.14△ 61.9±0.99△電針組 10 88.1±1.97#75.7±1.52#66.1±1.73#52.3±1.42#41.5±2.46#

表2 各組大鼠腦組織SOD、MDA水平比較（±s）

表2 各組大鼠腦組織SOD、MDA水平比較（±s）

注：△與假手術(shù)組比較，P＜0.05；#與模型組比較，P＜0.05。

假手術(shù)組 10 178.00±24.02 1.04±0.18模型組 10 111.40±2.07△ 3.30±0.12△電針組 10 174.60±2.76# 1.30±0.09#

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，VD是由于各種原因?qū)е履I精虧虛，痰瘀阻痹，使腦髓空虛，腦髓失養(yǎng)，其基本病機(jī)為髓減腦消，神機(jī)失用，屬于“癡呆”“善忘”等范疇。圍絕經(jīng)期VD又有其獨(dú)特的病因病機(jī)。婦女進(jìn)入圍絕經(jīng)期，腎氣漸衰，天癸將竭，沖任二脈虛損，腎精不足，臟腑功能紊亂，髓?？仗?，神機(jī)失守。故腎精虧虛為發(fā)病之本，治療以補(bǔ)腎益精為基本原則。三陰交是足太陰脾經(jīng)、足少陰腎經(jīng)和足厥陰肝經(jīng)三條陰經(jīng)交匯處。電針三陰交可以升高雌激素，抑制促性腺激素釋放激素（GnRH）分泌，調(diào)節(jié)下丘腦—腺垂體—卵巢軸，提高癡呆小鼠記憶能力[8]；關(guān)元穴位于有“陰脈之?！敝Q的任脈，可養(yǎng)肝脾之氣血，能夠補(bǔ)腎益精，調(diào)理沖任。兩穴合用，可以補(bǔ)腎益精，充盈髓海，達(dá)到補(bǔ)腎益腦之效。

西醫(yī)學(xué)認(rèn)為，因各種原因?qū)е碌哪X缺血所引起的腦損害是VD發(fā)病的主要原因之一，而自由基是腦缺血、缺氧后神經(jīng)細(xì)胞損傷的重要發(fā)病因素。自由基生成系統(tǒng)對(duì)學(xué)習(xí)記憶有明顯的損害作用，主要源于自由基對(duì)細(xì)胞及細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸的破壞、過(guò)氧化及MDA產(chǎn)生。MDA是脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)后的分解產(chǎn)物，其通過(guò)交鏈蛋白質(zhì)、糖類、核酸及脂類，使DNA發(fā)生突變，從而影響信息傳遞、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過(guò)程，致使蛋白質(zhì)合成功能紊亂，合成能力下降，從而表現(xiàn)出記憶力和智力下降。MDA含量間接反映了自由基損害程度，含量越高，損害程度越高。SOD是機(jī)體直接清除自由基的重要抗氧化酶類，是機(jī)體新陳代謝中重要的金屬酶，其可對(duì)抗與阻斷因氧自由基對(duì)細(xì)胞造成的損害，并及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞。前期研究表明，電針補(bǔ)腎益精法對(duì)圍絕經(jīng)期大鼠腦組織有一定保護(hù)作用[5]，能夠清除自由基，改善腦缺血、缺氧癥狀[9]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的Morris水迷宮定位航行逃避潛伏期時(shí)間明顯延長(zhǎng)，說(shuō)明VD模型建立成功，其存在明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙。與模型組比較，電針組大鼠的逃避潛伏期明顯縮短，說(shuō)明經(jīng)過(guò)一段時(shí)間“補(bǔ)腎益精”電針的治療，圍絕經(jīng)期VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力得到明顯改善。腦組織檢測(cè)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織SOD水平下降，MDA水平明顯上升，說(shuō)明腦組織SOD、MDA水平與VD存在一定聯(lián)系。與模型組比較，電針組大鼠腦組織SOD水平明顯上升，MDA水平明顯下降，說(shuō)明“補(bǔ)腎益精”電針?lè)捎行Ц纳茋^經(jīng)期VD模型大鼠腦組織SOD、MDA水平。

綜上，電針補(bǔ)腎益精法能提高圍絕經(jīng)期VD大鼠自身的抗氧化能力，減輕VD引起的組織過(guò)氧化損傷，減少M(fèi)DA含量，從而保護(hù)VD后繼發(fā)的神經(jīng)元損傷。本研究初步探討電針補(bǔ)腎益精法對(duì)圍絕經(jīng)期血管性癡呆大鼠腦保護(hù)機(jī)制，其他可能的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。