響應(yīng)面法優(yōu)化紅菊苣中花青素的提取工藝研究

王鳳娟， 孫飛龍， 葉文文， 寧景葉

（西安工程大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，陜西西安 710048）

紅菊苣（Cichoricumintybusvar.foliosumHegi）是海水蔬菜的一種，又名軟化白菊苣、軟化、結(jié)球紅菊苣、結(jié)球綠菊苣等，葉球鮮紅色，為野生菊苣（CichoricumintybusL.）的變種（朱建星等，2017）。 目前對其栽培技術(shù)、總黃酮提取工藝以及綠原酸的研究較多，對紅菊苣中花青素的研究還不夠深入（王記蓮等，2015）?；ㄇ嗨厥亲匀唤缫活悘V泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬黃酮類化合物，也是水果、蔬菜、花卉中的主要呈色物質(zhì)（付輝戰(zhàn)等，2017）。由于不同植物所含有的細胞液pH不同，因此呈現(xiàn)出不同的顏色。在自然條件下很少存在游離狀態(tài)的花青素，其主要以糖苷—花色苷的形式存在（鄭紅巖等，2014）。 D'Evoli等（2012）利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對紅菊苣花青素進行定性和定量分析，研究表明花青素具有消除自由基、降血脂、抗變異、延緩衰老、提高視力等生理活性。本文以酸性乙醇為提取劑，超聲輔助提取紅菊苣中的花青素，探討提取紅菊苣中花青素的提取工藝，為紅菊苣花青素提取工藝的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器 紅菊苣：將市售新鮮紅菊苣置于60℃電熱鼓風(fēng)干燥箱干燥24 h后，粉碎，過60目篩，密封裝袋，備用；鹽酸、氯化鉀、乙酸鈉均為分析純；蒸餾水為實驗室自制。

722型紫外可見分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；SK5200LH超聲波清洗儀，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；JBZ-100型高速多功能粉碎機，上海羅蘭德工貿(mào)有限公司；AL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；DGF-1AB型立式電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京科偉永興儀器有限公司；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵，鞏義市英峪予華儀器廠；三用電熱恒溫水箱，天津市泰斯特儀器有限公司；酸度計，上海任氏電子有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 技術(shù)路線 紅菊苣原材料→超聲波輔助乙醇提取→單因素試驗→響應(yīng)面優(yōu)化→抽濾→吸光值測定

1.2.2 試劑配制

pH=1.0 的緩沖溶液：0.2 mol/L KCl∶0.2mol/L HCl=25∶67，V/V；

pH=4.5 的緩沖溶液：0.2 mol/L NaAc·3H2O∶0.2 mol/L HAc（楊萍，2017）。

1.2.3 紅菊苣中花青素的測定 根據(jù)花色苷特有性質(zhì)，本試驗采用pH示差法測定花青素的含量（涂宗財?shù)龋?011），移取2.5 mL待測液定容到25 mL容量瓶中，取稀釋后的待測液2 mL，加入pH為 1.0、4.5的緩沖液 8 mL，30℃水浴平衡30 min，以蒸餾水作為空白對照，用紫外分光光度計測定花青素在520 nm和700 nm處的吸光值，以矢車菊-3-葡萄糖苷計，利用Fuleki公式對待測液中花青素含量進行測定（Fuleki，2010）。

式中：V為提取液總體積，mL；DF為稀釋倍數(shù)；M-Cy-3-Glu（矢車菊-3-葡萄糖苷）的相對分子質(zhì)量，449.2 g/mol；ε-Cy-3-Glu 的 消光系數(shù) ，29600 L/mol/cm；m 為樣品質(zhì)量，g；L 為光程，數(shù)值為1 cm。

1.3 紅菊苣中花青素提取的單因素試驗 分別考慮不同液固比、乙醇體積分數(shù)、超聲時間對花青素提取量的影響，進行單因素試驗，使用pH示差法對花青素含量進行測定，確定最佳提取因素。每個試驗平行三次。

1.3.1 液固比的確定 稱取6份一定質(zhì)量的紅菊苣于錐形瓶中，按液固比（mL：g）為 10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 與 70%酸性乙醇（含 0.1%鹽酸）混勻，在200W、40kHz條件下避光超聲30 min，抽濾提取液，冷卻，將濾液轉(zhuǎn)至25 mL燒杯中作為待測液。按照1.2.3紅菊苣中花青素的測定方法進行測定。

1.3.2 乙醇體積分數(shù)的確定 依照1.3.1中的方法，分析乙醇體積分數(shù)為30%、40%、50%、60%、70%、80%對紅菊苣中花青素提取量的影響。

1.3.3 超聲提取時間的確定 依照1.3.1中的方法， 分析超聲時間為 20、30、40、50、60、70 min 對紅菊苣中花青素提取量的影響。

1.4 響應(yīng)面法優(yōu)化紅菊苣中花青素的提取條件根據(jù)單因素試驗對液固比、乙醇體積分數(shù)、超聲提取時間進行綜合考慮，采用三因素三水平響應(yīng)面分析法，根據(jù)Box-Behnken Design（BBD）設(shè)計響應(yīng)面試驗，分析紅菊苣花青素在不同提取條件下的含量，從而優(yōu)化出最佳提取條件（王鳳娟等，2017；Zhao等，2015）。試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 中心組合Box-Behnken因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 液固比對紅菊苣中花青素提取量的影響從圖1可以看出，隨著液固比的增加，花青素提取量也增加，并在液固比為40∶1時，花青素提取量最多。繼續(xù)增加液固比，花青素提取量減少，因為在一定提取溫度下，花青素的溶解度是一定的，因此隨著提取溶劑的增加，花青素提取量也增加，當(dāng)提取劑達到某一值時，花青素不再溶解，此時再增加溶劑體積，不僅增加成本，而且使其雜質(zhì)含量也增加，故選擇液固比為40∶1為宜（武中庸等，2017）。

圖1 液固比對花青素提取量的影響

2.2 乙醇體積分數(shù)對紅菊苣中花青素提取量的影響 從圖2可以看出，花青素提取量隨乙醇體積分數(shù)增加而增加，在乙醇體積分數(shù)為70%時達到最大，之后隨乙醇體積分數(shù)的增加而減少，主要原因是乙醇體積分數(shù)越大，提取劑極性越大，導(dǎo)致花青素溶解度下降，故乙醇體積分數(shù)應(yīng)選擇70%。

圖2 乙醇體積分數(shù)對花青素提取量的影響

2.3 超聲提取時間對紅菊苣中花青素提取量的影響 從圖3可以看出，初始時，超聲提取時間越長花青素提取量越高，當(dāng)超聲提取時間為30 min時花青素的提取量最高，隨后呈下降趨勢。由于超聲波的空化效應(yīng)和機械作用會破壞花青素結(jié)構(gòu)，并且隨著超聲時間增長提取溫度相應(yīng)的升高，高溫會導(dǎo)致花青素分解，降低提取量。故超聲提取時間為30 min。

圖3 超聲提取時間對花青素提取量的影響

3 響應(yīng)面法優(yōu)化紅菊苣中花青素的提取工藝研究結(jié)果

3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 利用Box-Behnken Design試驗設(shè)計原理，選取液固比、乙醇體積分數(shù)、超聲提取時間進行三因素三水平試驗分析，共17個試驗點，響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

利用Design-Expert 8.05b軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行方差分析和多元回歸擬合，方差分析結(jié)果見表3。擬合的多元回歸方程為：Y＝908.58+1.73A+6.58B-14.52C+28.20AB-25.60AC-4.75BC-58.06A2-40.38B2-45.96C2。整體模型顯著性水平P＜0.0001，表明二次方程模型達到極度顯著水平；回歸方程的相關(guān)系數(shù) （R2＝0.9886，Adj-R2＝0.9739，Pred-R2＝0.8522）及變異系數(shù) CV（0.98%）均表明模型方程能夠較好地反映真實的試驗值。因此，可以用該模型對試驗結(jié)果進行分析及預(yù)測。從表3可以看出，超聲提取時間一次項以及液固比、超聲功率、提取時間的二次項，以及液固比和乙醇體積分數(shù)的交互項、液固比和超聲提取時間的交互項對響應(yīng)值的影響都達到極顯著水平（P＜0.01），響應(yīng)值的變化較復(fù)雜，各個試驗因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，而應(yīng)呈二次拋物面關(guān)系。從各變量顯著性檢驗P的大小，可以得出所研究各因素對紅菊苣中花青素提取效果影響大小順序依次為超聲提取時間＞乙醇體積分數(shù)＞液固比。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

3.2 交互項對試驗結(jié)果的影響 三維響應(yīng)面圖可更直觀的看出兩因素對因變量的影響情況，可以直接找出最優(yōu)范圍，三維響應(yīng)面在底面的投影圖即為二維等高線圖，響應(yīng)面坡度越平緩，外界影響條件對其影響越小，響應(yīng)值的大小變化越小。比較分析圖4～圖6兩兩交互作用大小依次為液固比和乙醇體積分數(shù)，液固比和超聲提取時間，乙醇體積分數(shù)和超聲提取時間。

圖4 液固比和乙醇體積分數(shù)對試驗結(jié)果的影響

圖5 液固比和超聲提取時間對試驗結(jié)果的影響

圖6 乙醇體積分數(shù)和超聲提取時間對試驗結(jié)果的影響

3.3 紅菊苣中花青素提取最優(yōu)工藝及其驗證經(jīng)過響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，確定的最優(yōu)提取條件為液固比40.86∶1，乙醇體積分數(shù)為71.22%，超聲提取時間為28.12 min，花青素的提取量為910.426 mg/100g。為了操作方便，將上述條件修正為液固比41∶1，乙醇體積分數(shù)71%，超聲提取時間28 min，在此條件下進行3次平行試驗，花青素提取量為908.596 mg/100 g，RSD為0.1%，與理論值相比誤差為1.83 mg/100 g。

4 結(jié)論

采用超聲波輔助提取紅菊苣中花青素，通過以液固比、乙醇體積分數(shù)、超聲提取時間為提取單因素，采用響應(yīng)面分析法進行三因素三水平的優(yōu)化設(shè)計試驗。分析結(jié)果表明，3個因素中對花青素提取量影響大小為超聲提取時間＞乙醇體積分數(shù)＞液固比。最佳提取工藝為液固比41∶1，乙醇體積分數(shù)71%，超聲提取時間28 min，在此條件下，花青素的提取量為908.596 mg/100 g，與模型中預(yù)測值910.426 mg/100 g相差不大，模型可用于實際預(yù)測。