中等強度運動對2型糖尿病大鼠間充質(zhì)干細胞的影響

王 瑋

(安陽師范學(xué)院，河南 安陽 455000)

研究證明，糖尿病患者骨代謝易紊亂，常常并發(fā)糖尿病骨質(zhì)疏松(DOP)，其骨折和致殘性較高。目前關(guān)于DOP問題，大都從高血糖環(huán)境、糖基化終末期產(chǎn)物、胰島素、微量元素等角度入手進行防治〔1，2〕；而對于肥胖型糖尿病患者，也有從瘦素、脂聯(lián)素的角度入手〔3〕。間充質(zhì)干細胞(MSCs)是一種多潛能成體干細胞，在一定的誘導(dǎo)條件下，MSCs具有向成骨細胞分化的功能〔4〕。本研究從骨髓MSC(BMSC)的角度入手，旨在探究糖尿病大鼠BMSC向成骨細胞分化能力的改變，同時觀察中等強度運動對糖尿病大鼠BMSC的成骨誘導(dǎo)能力是否存在有影響，為運動干預(yù)DOP提供一定參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1動物建模與分組 40只6周齡雄性清潔級SD大鼠購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。按體重分層分為對照組(n=8)和糖尿病建模組(n=32)。對照組用普通飼料喂養(yǎng)；糖尿病建模組用高脂飼料(飼料配方：2.5%膽固醇，1%膽酸鈉，10%白糖，10%豬油，66.5%普通飼料)喂養(yǎng)8 w后以30 mg/kg的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建糖尿病模型。注射STZ后的第3天和第7天測空腹血糖，空腹血糖>11.1 mmol/L視為建模成功，將建模失敗的大鼠(n=15)剔除。隨后將建模成功的大鼠按體重分層分為糖尿病組(n=9)和糖尿病運動組(n=8)，均改為普通飼料喂養(yǎng)。

1.2運動方案 糖尿病運動組參照Petzinger等〔5〕進行跑臺運動干預(yù)，跑臺坡度為0°，每周運動6 d，周日休息，運動方案為第1周15 m/min 30 min、第2周15 m/min 60 min、第3周20 m/min 60 min、第4周20 m/min 90 min。

1.3動物取材 運動結(jié)束后，于處死當天稱重。乙醚麻醉，大鼠心臟取靜脈血死亡，每組取5只右側(cè)脛骨提取BMSC，加2 ml紅細胞裂解液，進行破紅處理。其中2只右腿脛骨的細胞以每孔5×106的密度鋪于6孔板上，利用平板計數(shù)法(CFU)檢測其增殖情況；3只右腿脛骨BMSC分別種至大皿中，體外分離培養(yǎng)，7 d后提取BMSC 中總RNA用RT-PCR法檢測Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Runx)2、核因子κB受體活化因子(RANK)和RANK配體(L)mRNA的表達。

1.4CFU形成實驗和堿性磷酸酶(ALP)染色 細胞培養(yǎng)5 d后，培養(yǎng)基由低糖換成成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液；培養(yǎng)2 d后，將6孔板從溫箱取出，1×磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩次，4%多聚甲醛(PFA)固定20 min后，1×PBS洗3次，避光加ALP染料30 min后，1×PBS洗一次，加1×PBS后進行掃描。

1.5BMSC Runx2、RANK和RANKL mRNA定量檢測 將種植于大皿的BMSC 7 d后按照RNA的提取步驟，提取RNA。經(jīng)過酶標儀檢測出每個樣本RNA的純度和濃度后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟，將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用試劑盒，對樣本中Runx2 mRNA、RANK mRNA和RANKL mRNA進行定量檢測。在Pubmed數(shù)據(jù)庫查詢大鼠Runx2、RANK、RANKL和GAPDH基因引物序列，后用Primer Express3.0 軟件檢測引物(表1)，引物由谷歌生物公司合成。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析和LSD-t檢驗。

表1 RT-PCR 引物序列

2 結(jié) 果

2.1各組體重比較 建模成功開始運動時，糖尿病組、糖尿病運動組體重與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但糖尿病組和糖尿病運動組體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；1 w后，糖尿病組體重較對照組顯著偏低(P<0.01)，糖尿病組和糖尿病運動組之間仍未出現(xiàn)差異；2 w后各組體重和1 w后的結(jié)果一致；3 w后，糖尿病組體重較對照組顯著偏低(P<0.01)，糖尿病組和糖尿病運動組體重出現(xiàn)差異，糖尿病運動組偏低(P<0.05)；4 w跑臺運動結(jié)束后，糖尿病組體重較對照組顯著偏低(P<0.01)，糖尿病組和糖尿病運動組無顯著差異(P>0.05)。見表2。

2.2CFU形成實驗和ALP染色 糖尿病運動組6孔板的成骨細胞數(shù)目最多，并且顯著多于糖尿病組，表明運動可以促進糖尿病組BMSC體外誘導(dǎo)分化為成骨細胞。見圖1。

表2 各組體重比較

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與糖尿病組比較：3)P<0.05

2.3BMSC Runx2、RANK和RANKL mRNA的定量檢測結(jié)果 與對照組相比，糖尿病組Runx2 mRNA表達顯著下調(diào)(P<0.05)；與糖尿病組相比，糖尿病運動組Runx2 mRNA表達顯著上調(diào)(P<0.01)。與對照組相比，糖尿病組RANK、RANKL mRNA表達顯著上調(diào)(P<0.05)；與糖尿病組相比，糖尿病運動組RANK mRNA表達顯著下調(diào)(P<0.05)。見表3。

圖1 各組BMSC ALP染色

組別nRunx2RANKRANKL對照組80.126 7±0.058 90.001 6±0.000 70.000 1±0.000 0糖尿病組90.033 6±0.039 31)0.121 1±0.131 62)0.003 1±0.004 21)糖尿病運動組80.180 7±0.092 34)0.001 5±0.000 34)0.000 0±0.000 03)

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與糖尿病組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

3 討 論

轉(zhuǎn)錄因子Runx2是成骨細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，能激活和啟動BMSC向成骨細胞系分化，同時調(diào)節(jié)成骨細胞的分化和功能，對骨組織的形成和骨重建起著至關(guān)重要作用〔6〕；RANKL/RANK/骨保護素(OPG)信號通路在成骨細胞及破骨細胞的通訊中起著關(guān)鍵作用，成骨細胞通過改變OPG和RANKL的合成，從而間接調(diào)節(jié)破骨細胞的分化和成熟。RANK結(jié)合RANKL能夠促進破骨細胞的分化及成熟。但在這個過程中，OPG作為一種誘餌受體，可以阻斷RANK和RANKL結(jié)合，骨吸收和骨形成達到平衡的關(guān)鍵就在于RANKL/OPG比值〔7〕。OPG含量低，RANKL/OPG比值高則有利于骨吸收。

本研究表明運動可以降低糖尿病大鼠的體重。糖尿病患者體內(nèi)胰島素都存在分泌失調(diào)或作用障礙，胰島素分泌不足可造成骨代謝紊亂，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，并且胰島素水平越低，骨代謝異常越明顯。胰島素可直接刺激成骨細胞，促進其細胞內(nèi)氨基酸蓄積、骨膠原及骨基質(zhì)的合成分泌。OPG由成骨/基質(zhì)細胞旁分泌的可溶性因子，在破骨細胞增殖及分化中起關(guān)鍵作用。當胰島素分泌不足，OPG水平會降低，RANKL/OPG的比值升高將有利于骨吸收〔2，8〕。胰島素還可通過抑制腺苷酸環(huán)化酶(cAMP)合成，減少促進骨吸收〔9〕，抑制高血糖對BMSCs的毒性作用促進骨吸收等〔10〕。運動可提高胰島素敏感性，改善胰島素抵抗〔11〕。原因可能是提高了糖原合成相關(guān)酶的活性和數(shù)量、改善胰島素受體后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，上調(diào)肌肉葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白等機制來提高胰島素敏感性〔12〕。但是程守科等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)，劇烈運動后短時間內(nèi)胰島素的敏感性下降，運動中過度氧化是胰島素敏感下降的重要原因。

同時，肥胖會刺激瘦素分泌，分泌過多則又易導(dǎo)致瘦素抵抗，同時引起脂聯(lián)素的水平下降。瘦素和脂聯(lián)素是脂肪細胞中兩大重要細胞因子，其參數(shù)水平異常則導(dǎo)致骨代謝異常。外周血和組織中瘦素直接作用于相關(guān)細胞(譬如BMSCs)刺激骨形成，通過RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)抑制骨吸收〔14〕。衣雪潔等〔15〕發(fā)現(xiàn)，耐力訓(xùn)練可明顯降低體脂和血瘦素水平，上調(diào)脂肪的瘦素受體的基因表達，有效地緩解瘦素抵抗，中等強度的運動也可明顯增加血液脂聯(lián)素水平〔16〕。而一次性急性運動對瘦素和脂聯(lián)素水平改善沒有顯著作用。

BMSC來源于中胚層——四肢骨骼，是存在于骨髓基質(zhì)中的一種多能干細胞，屬于成體干細胞。連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后具有多向分化潛能。在一定的微環(huán)境或培養(yǎng)條件下，BMSCs可分化為軟骨細胞、成骨細胞、成纖維細胞、脂肪細胞等多種間充質(zhì)細胞。在體外特定的誘導(dǎo)條件下，BMSCs還可跨越胚層界限，向內(nèi)胚層和神經(jīng)外胚層來源的多種組織細胞分化。骨細胞生理的一個重要特點就是破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收與成骨細胞介導(dǎo)的新骨形成之間的聯(lián)系。破骨細胞(骨吸收)是多核細胞來源于肝星狀細胞譜系中的巨噬細胞和單核細胞；成骨細胞，骨基質(zhì)沉淀鈣化和脂肪細胞都來源于BMSC，骨髓內(nèi)脂肪細胞增加可影響成骨細胞的分化和功能，增加破骨細胞活性，影響骨礦化〔17〕。高血糖會抑制BMSC向成骨細胞的分化〔11〕。本次研究與上述的研究一致；表明糖尿病會抑制大鼠BMSC向成骨細胞分化，促進破骨形成。高血糖環(huán)境對某些骨代謝信號產(chǎn)生影響，會使Wnt/β-catenin和RANKL/RANK/OPG信號通路失調(diào)〔18〕。

細胞能增殖再生意味著有生存能力，但貼壁后的細胞不一定每個都能增殖和形成克隆，而形成克隆的細胞必須為貼壁和有增殖活力的細胞。本文結(jié)果表明運動可以改善糖尿病大鼠BMSC向成骨細胞分化的能力；運動可以抑制糖尿病大鼠BMSC向破骨細胞分化的能力。OPG-RANKL-RANK 系統(tǒng)是調(diào)節(jié)破骨細胞分化和骨吸收功能發(fā)揮的一個重要信號通路，還是聯(lián)系成骨細胞與破骨細胞之間通訊的重要紐帶〔19〕。本研究結(jié)果表明，運動可能會影響B(tài)MSC向成骨細胞分化的潛能，這與先前的研究相一致〔20～22〕。研究報道，運動可以增加小鼠血清雄激素水平，增加抑制破骨細胞形成和骨吸收的細胞因子水平〔23〕。此外，運動過程中應(yīng)力的刺激通過相關(guān)信號通路〔轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β/骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)、Wnt〕對BMSC向成骨細胞分化產(chǎn)生影響〔24〕。應(yīng)力的刺激對BMSC向成骨細胞分化主要體現(xiàn)在運動強度及運動持續(xù)的時間上，當運動強度過高、持續(xù)時間長時，運動不利于BMSC向成骨細胞分化，其原因可能是造成了細胞機械磨損，從而阻礙了相關(guān)的信號通路〔25〕。運動時本身由于需氧量的增加引起氧化應(yīng)激，釋放活性氧(ROS)，低劑量ROS可以促進相關(guān)信號通路(MAPK)，使成骨細胞增殖分化，中等劑量則會使其短暫或永久地停止生長，而大劑量則會使其凋亡壞死〔26〕。ROS含量與運動強度、時間密切相關(guān)。長時間大強度的運動時，需要更多的氧氣，因此ROS含量也會越高。如果ROS不能被及時清除，不利于成骨細胞的分化。此外，急性劇烈運動時，機體抗氧化系統(tǒng)也是不足以平衡氧化系統(tǒng)，從而造成ROS過剩。本文結(jié)果證實，中等強度運動是可以改善糖尿病鼠BMSC向成骨細胞的分化能力。