Cx43、Shh與P-Ezrin蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及意義

潘理會(huì) 霍 峰 李春輝

(承德醫(yī)學(xué)院生物工程研究室，河北 承德 067000)

胃癌的發(fā)生、發(fā)展因素眾多、步驟復(fù)雜，并涉及多方面機(jī)制。迄今為止，關(guān)于胃癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)胃癌的發(fā)生機(jī)制可能與間隙連接-43(Cx43)、Hedgehog通路與活化的細(xì)胞骨架連接蛋白(P-Ezrin)相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)通過比較Cx43、Shh與P-Ezrin蛋白在正常胃黏膜與胃癌組織中的表達(dá)來分析三者與胃癌臨床病理特征間的關(guān)系及Cx43、Shh與P-Ezrin之間的相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 收集承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2014年3月至2015年10月手術(shù)切除經(jīng)病理證實(shí)的胃癌組織標(biāo)本120例，患者術(shù)前均未接受放化療，正常胃組織(距離腫瘤10 cm以上視為正常胃組織作為對(duì)照)50例。120例胃癌患者中，男73例，女47例，年齡29～85〔平均(55.01±10.4)〕歲；>55歲64例，≤55歲56例；高中分化者52例，低分化者68例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者50例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者70例；未侵及漿膜層者50例，侵及漿膜層者70例；TNM分期Ⅰ+Ⅱ期53例，Ⅲ+Ⅳ期67例。

1.2主要試劑和儀器 免疫組織化學(xué)試劑鼠抗人Cx43、Shh及P-Ezrin 抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Western印跡所用試劑兔抗人一抗Cx43、Shh及P-Ezrin 抗體購自Bioword Technology公司，RIPA組織裂解液(BB120031)購自上海貝博公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，羊抗兔辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗及電化學(xué)發(fā)光(ECL)超敏發(fā)光液均購自北京索萊寶科技有限公司，免疫組織化學(xué)所需儀器全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)(美國VENTANA，Roche公司)，Western印跡所用儀器紫外分光光度儀(DU800 美國貝克曼公司)，酶標(biāo)儀MK3(Thermo labsystems公司)。

1.3免疫組織化學(xué)法 正常胃組織與胃癌組織常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片4 μm貼附于經(jīng)多聚賴氨酸處理的玻片上，80℃烘烤50 min，將切片放入免疫組織化學(xué)染色機(jī)按正常程序運(yùn)行，用磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗(其余染色步驟相同)作為陰性對(duì)照，用已知正常胃組織的陽性切片作為陽性對(duì)照。光鏡下觀察切片中Cx43、Shh及Ezrin蛋白的表達(dá)和分布情況，每張切片選取5個(gè)高倍視野(×400)。Cx43蛋白陽性主要分布于細(xì)胞質(zhì)或胞膜上，呈棕黃色顆粒。Shh蛋白陽性主要分布于細(xì)胞質(zhì)，呈棕褐色顆粒。Ezrin蛋白陽性主要分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色顆粒分布。判斷標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)考慮染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分率： Cx43、Shh按染色強(qiáng)度分級(jí)，無著色為0分，淡黃為1分，黃或深黃2分，褐或棕黃3分；陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)<10%為0分，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)10%～25%為1分，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)26%～50%為2分，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)51%～75%為3分，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)≥76%為4分。兩者相加<2 分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中等強(qiáng)度陽性()，6～7分為強(qiáng)陽性()。Ezrin蛋白按染色強(qiáng)度分級(jí)，無著色為0分，黃或深黃為1 分，棕黃或褐色2 分，深褐色為3分；陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)<15%為0分，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)16%～30%為1 分，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)31%～50%為2分，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)51%～70%為3分，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)≥71%為4分。兩者相加<2分為陰性(-)，2～3 分為弱陽性(+)，4～5分為中等強(qiáng)度陽性()，6～7 分為強(qiáng)陽性()。結(jié)果判定由兩名具備高級(jí)職稱的病理醫(yī)師經(jīng)雙盲法獨(dú)立評(píng)分。

1.4Western印跡技術(shù) 取新鮮組織稱量后置于勻漿器內(nèi)，加入裂解液和苯甲基磺酰氟(PMSF)充分勻漿離心后提取組織蛋白。應(yīng)用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，并計(jì)算出蛋白上樣體積，加入上樣緩沖液后100 ℃水浴10 min。水浴的蛋白依次進(jìn)行SDS-PAGE電泳(12%分離膠+5%濃縮膠)、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗和顯影等步驟。顯影后膠片采用Quantity one圖像分析軟件對(duì)蛋白電泳條帶灰度值進(jìn)行定量分析，按照下列公式計(jì)算：蛋白相對(duì)定量=目的蛋白灰度值/同標(biāo)本GAPDH內(nèi)參灰度值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件行t及秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1免疫組織化學(xué)Cx43、Shh及P-Ezrin在胃癌組織和正常組織中的表達(dá) Cx43、Shh及P-Ezrin陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)，Cx43正常胃組織中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，在高-中分化胃癌組織中呈陽性表達(dá)，在低分化胃癌組織中呈弱陽性表達(dá)；Shh及P-Ezrin在正常胃組織中呈陰性表達(dá)，在高-中分化胃癌組織中呈陽性表達(dá)，在低分化胃癌組織中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，見圖1。

2.2Western印跡法對(duì)胃癌組織和正常組織中的Cx43、Shh及P-Ezrin進(jìn)行蛋白定量分析 正常胃組織Cx43蛋白的相對(duì)含量(0.93±0.09)明顯高于胃癌組織Cx43蛋白的相對(duì)含量(0.11±0.05)，正常胃組織Shh(0.24±0.02)和P-Ezrin(0.36±0.03)中蛋白的相對(duì)含量明顯低于胃癌組織(1.17±0.31，2.18±0.54，P<0.05)；Cx43、Shh及P-Ezrin的表達(dá)與胃癌的分化程度有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胃癌的浸潤深度(侵及漿膜層)、TNM分期有關(guān)(P<0.05)，與患者的性別和年齡無關(guān)(P>0.05)，見圖2、表1。

圖1 Cx43、Shh及P-Ezrin在胃癌組織和正常組織中的表達(dá)(IHC，×200)

臨床病理特征nCx43 P值Shh P值P-EzrinP值年齡 >55歲640.27±0.030.4731.23±0.120.4851.74±0.180.187 ≤55歲560.34±0.031.07±0.112.07±0.21性別 男性731.53±0.640.3430.97±0.100.2811.87±0.190.218 女性471.86±0.821.38±0.142.01±0.20分化程度 高-中分化520.41±0.040.0010.7±0.070.0040.90±0.090.000 低分化 680.07±0.011.62±0.163.31±0.32TNM分期 Ⅰ+Ⅱ期530.43±0.040.0030.74±0.070.0100.85±0.090.007 Ⅲ+Ⅳ期670.06±0.011.67±0.173.47±0.35侵及漿膜 是700.39±0.030.0070.77±0.080.0160.90±0.090.011 否500.07±0.011.58±0.163.33±0.33淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 是700.38±0.040.0000.72±0.070.0010.97±0.100.003 否500.07±0.011.66±0.173.29±0.33

1.正常胃組織；2.高-中分化胃癌組織；3.低分化胃癌組織圖2 正常胃組織和胃癌組織中Cx43,Shh及P-Ezrin蛋白Western印跡電泳

2.3Cx43與Shh，P-Ezrin蛋白在胃癌中表達(dá)的相關(guān)性 胃癌中：Cx43與Shh表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.733，P=0.000)；Cx43與P-Ezrin呈負(fù)相關(guān)(r=-0.896，P=0.000);Shh與P-Ezrin蛋白呈正相關(guān)(r=0.911，P=0.000)。

3 討 論

Cx43蛋白作為縫隙連接通道的組成部分，在細(xì)胞間存在信息交流，發(fā)揮細(xì)胞間接觸抑制的作用，正常細(xì)胞及癌旁細(xì)胞中均陽性表達(dá)。相反，在腫瘤細(xì)胞接觸抑制的作用常常消失〔1〕，而在癌細(xì)胞中最重要的就是細(xì)胞間接觸抑制消失，導(dǎo)致了Cx43在癌組織中表達(dá)明顯下降。Li等〔2〕研究結(jié)果顯示正常胃黏膜中Cx43蛋白的表達(dá)量明顯比胃癌組織高，而且在正常胃黏膜中完全表達(dá)。Tang等〔3〕研究發(fā)現(xiàn)胃腫瘤細(xì)胞與鄰近正常上皮細(xì)胞相比，Cx43蛋白呈顯著低表達(dá)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的腫瘤細(xì)胞與胃原發(fā)的腫瘤細(xì)胞相比，Cx43蛋白亦呈顯著高表達(dá)，進(jìn)而提出Cx43的低表達(dá)可能有助于胃癌的發(fā)生。本研究結(jié)果表明Cx43參與了胃癌轉(zhuǎn)移的過程，所以Cx43有可能成為胃癌預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)及胃癌治療的新的作用靶點(diǎn)。

在哺乳動(dòng)物中，目前已確定了三個(gè)Hh家族成員Sonic Hedgehog(Shh)、Indian Hedgehog(Ihh)和Desert Hedgehog(Dhh)，分別編碼為具有自我催化能力的Shh、Ihh和Dhh蛋白〔4〕。目前的研究主要集中于Shh信號(hào)通路,它對(duì)哺乳動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚、乳腺及胃腸、前列腺等多器官的發(fā)育起重要作用。Yao等〔5〕研究證明Shh與皮膚基底細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、口腔癌等的發(fā)生與發(fā)展均有密切關(guān)系，Alam等〔6〕發(fā)現(xiàn)在肺癌細(xì)胞系中均存在Shh的高水平表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為Shh蛋白是胃癌惡性度高、預(yù)后差的預(yù)測(cè)因子，提供了對(duì)胃癌預(yù)后的判斷，提示Shh是胃癌發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵作用點(diǎn)，有可能成為胃癌的診斷標(biāo)志物及一個(gè)新的目標(biāo)靶點(diǎn)?；罨腅zrin(P-Ezrin)有可能介導(dǎo)胃癌的發(fā)生、發(fā)展，去磷酸化可能是其失活的機(jī)制，當(dāng)磷酸化的Ezrin再去磷酸化后，就可能恢復(fù)原來狀態(tài)，使結(jié)合位點(diǎn)失活。Ezrin的失活與激活同樣重要，失活得以調(diào)控與特異膜表面部位結(jié)合的Ezrin數(shù)量。磷酸化與去磷酸化保持在平衡狀態(tài)以維持機(jī)體正常的生理功能。腫瘤最主要的死因是它引起的侵襲及轉(zhuǎn)移所表現(xiàn)復(fù)雜行為的結(jié)果，腫瘤細(xì)胞為了能夠成功轉(zhuǎn)移必須逃脫許多機(jī)體免疫防御機(jī)制，因此，越來越多的研究證實(shí)，Ezrin在包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤中存在高表達(dá)，且與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔7～12〕。Yu等〔13,14〕均報(bào)道Ezrin的表達(dá)在鼠橫紋肌肉瘤和骨肉瘤的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，抑制Ezrin蛋白的表達(dá)后，兩類細(xì)胞株的轉(zhuǎn)移能力大大降低，當(dāng)Ezrin蛋白高度表達(dá)后可使原來無轉(zhuǎn)移特性的細(xì)胞獲得較高的轉(zhuǎn)移能力，顯示Ezrin蛋白是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，并且是預(yù)后差的指標(biāo)。 本研究結(jié)果顯示，隨著胃癌惡性程度和臨床分期的增高，P-Ezrin的表達(dá)隨之增強(qiáng)，與Yu等〔13,14〕報(bào)道結(jié)果符合。

Cx43 磷酸化過程能夠影響 GJ 的通透性、電導(dǎo)率、門控特性等，從而對(duì)細(xì)胞間通訊產(chǎn)生各種作用，進(jìn)而在體內(nèi)外影響生理或者病理過程。本研究證實(shí)，Cx43與Shh和 P-Ezrin呈負(fù)反饋調(diào)節(jié)，Shh與P-Ezrin之間顯示正反饋的作用，提示Cx43可調(diào)節(jié)Hedgehog信號(hào)通路，使其在腫瘤細(xì)胞中具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與分化作用，并且正反饋調(diào)節(jié) P-Ezrin基因和蛋白的表達(dá)，細(xì)胞間黏附減少，運(yùn)動(dòng)增加，細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲能力。