益氣活血方動(dòng)員骨髓干細(xì)胞對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠JAK2-PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)的動(dòng)態(tài)影響

李鑫輝 黃政德 黃淼鑫 杜建芳 李雅婧 許福麗 肖 青 郭晨鶴 徐瑪麗

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

心肌缺血再灌注損傷(IRI)是目前治療心肌缺血及預(yù)后所面臨的主要難題之一，如何有效預(yù)防和治療心肌IRI是近年臨床和科研的研究熱點(diǎn)，有研究證明凋亡在IRI中起主導(dǎo)作用〔1〕。目前運(yùn)用干細(xì)胞技術(shù)治療IRI研究主要包括干細(xì)胞移植技術(shù)和干細(xì)胞動(dòng)員技術(shù)〔2〕，前者繁瑣，需要分離培養(yǎng)、移植等，而經(jīng)動(dòng)員后的骨髓干細(xì)胞可自行歸巢于缺血區(qū)，并分化為內(nèi)皮細(xì)胞及心肌細(xì)胞，相對(duì)簡(jiǎn)單，無(wú)創(chuàng)傷性，因而受到關(guān)注。有研究表明中藥可以影響干細(xì)胞的動(dòng)員、歸巢，對(duì)干細(xì)胞治療缺血性心肌病起到優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)、協(xié)同增效的作用〔3,4〕。本研究探討益氣活血方動(dòng)員骨髓干細(xì)胞對(duì)心肌IRI大鼠JAK2-PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)的動(dòng)態(tài)影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物、主要試劑及儀器 SD大鼠144只，體重200～250 g。由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK(湘)2009-0001。JAK2，一抗，武漢博士德公司；PI3K，一抗，武漢博士德公司；多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)，RM-6280型，成都儀器廠制造；島津分光光度計(jì)，UV-1700 PharmaSpec型，Japan；顯微攝像系統(tǒng)，Motic B5型，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司；益氣活血方藥(紅花5 g，生地15 g，黃芪25 g，丹參20 g，檀香5 g，赤芍10 g，川芎10 g，當(dāng)歸10 g等)，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房提供并經(jīng)過(guò)浸泡，去渣，水煎濃縮至藥液濃度1 g/ml(含生藥)，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1造模方法 大鼠用10%水合氯醛麻醉后開(kāi)胸，找到位于左心耳和肺動(dòng)脈圓錐間與左冠狀動(dòng)脈伴行的冠狀靜脈，并以此靜脈為標(biāo)志進(jìn)行結(jié)扎當(dāng)心電圖呈現(xiàn)ST段、T波進(jìn)行性抬高，為心肌缺血的標(biāo)志。以ST段下移，缺血部位心肌顏色恢復(fù)為血流再灌注成功。

1.2.2動(dòng)物分組及給藥方法 大鼠144只隨機(jī)分組，于造模后3個(gè)不同時(shí)間段觀察，A：假手術(shù)組；B：IRI組；C：重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)動(dòng)員組；D:益氣活血方組；E:益氣活血方聯(lián)合動(dòng)員組;F:LY294002組(益氣活血方聯(lián)合動(dòng)員+PI3K的特異性阻斷劑組)，每組8只。A組只穿線不結(jié)扎，其余各組行IRI手術(shù)，結(jié)扎冠脈30 min后恢復(fù)血流；C、E和F組在腹腔注射rhEPO(2 000 U/kg)，每天1次，連續(xù)3 d(即造模前1 d、造模當(dāng)天、造模后1 d)，A、B和D組注射等劑量生理鹽水；F組在結(jié)扎前30 min，尾靜脈注射PI3K的阻斷劑LY294002(0.3 mg/kg)。按人(60 kg)與動(dòng)物體表面積折算劑量給藥，D、E和F組，灌胃益氣活血方藥10 ml·kg-1·d-1〔相當(dāng)于生藥含量10 g·kg-1·d-1〕5 d(即造模前2 d、造模后3 d)，每天1次；A、B和C組灌胃等量0.9%NaCl溶液5 d，每天1次。

1.2.3心肌細(xì)胞JAK2、PI3K蛋白表達(dá)測(cè)定 在造模型后7 d，14 d，28 d將動(dòng)物處死，取各組缺血心肌組織制作免疫組化病理切片(4 μm厚)，各組蛋白表達(dá)采用免疫組化法進(jìn)行檢測(cè)，按試劑盒使用說(shuō)明書操作。圖像分析：每張切片隨機(jī)在顯微鏡400倍下取5個(gè)視野，用彩色病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)量平均光密度(OD值)。

1.2.4心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè) 在造模型后28 d將動(dòng)物處死取各組缺血心肌組織，4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋并制成病理切片(4 μm厚)，采用TUNEL法檢測(cè)，按試劑盒說(shuō)明書操作。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1益氣活血方動(dòng)員骨髓干細(xì)胞對(duì)心肌IRI大鼠心肌細(xì)胞JAK2蛋白表達(dá)的影響 B組在各時(shí)間點(diǎn)JAK2蛋白表達(dá)與A組比較明顯降低(P<0.01)，而與B組比較，在各時(shí)間點(diǎn)C、D和E組JAK2蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與C，D組比較，E組JAK2表達(dá)升高，但在7 d時(shí)無(wú)顯著差異，在14 d，28 d明顯升高(P<0.05，P<0.01)。F組較E組明顯降低，顯示益氣活血方聯(lián)合動(dòng)員骨髓干細(xì)胞可以明顯提高JAK2蛋白表達(dá)，且時(shí)間越久作用越明顯。見(jiàn)表1，圖1。

表1 各組心肌JAK2蛋白表達(dá)

與A組比較：1)P<0.01；與B組比較：2)P<0.01；與E組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

圖1 7 d、14 d各組心肌JAK2蛋白表達(dá)免疫組化觀察(DAB，×400)

2.2益氣活血方動(dòng)員骨髓干細(xì)胞對(duì)心肌IRI大鼠心肌細(xì)胞PI3K蛋白表達(dá)的影響 B組在各時(shí)間點(diǎn)PI3K蛋白表達(dá)與A組比較明顯降低(P<0.01)。與B組比較，在各時(shí)間點(diǎn)C、D和E組PI3K蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05，P<0.01)；與C，D組比較，E組在各時(shí)間點(diǎn)PI3K表達(dá)明顯升高(P<0.05，P<0.01)。F組較E組明顯降低，顯示益氣活血方聯(lián)合動(dòng)員骨髓干細(xì)胞可以明顯提高PI3K蛋白表達(dá)，且隨著時(shí)間推移提高PI3K蛋白表達(dá)作用越明顯。見(jiàn)表2，圖3。

2.3益氣活血方動(dòng)員骨髓干細(xì)胞對(duì)心肌IRI大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響 28d時(shí)結(jié)果顯示，B組〔(60.87±4.55)%〕與A組比較明顯升高〔(29.25±2.96)%，P<0.01〕，且與B組比較，C〔(45.62±2.00)%〕、D〔(42.50±2.00)%〕和E組〔(35.37±1.92)%〕心肌細(xì)胞凋亡明顯降低(P<0.01)，而與C，D組比較，E組心肌細(xì)胞凋亡明顯降低(P<0.01，P<0.05)。F組〔(39.12±1.42)%〕較E組心肌細(xì)胞凋亡明顯升高，顯示益氣活血方聯(lián)合動(dòng)員骨髓干細(xì)胞可以明顯減低心肌細(xì)胞凋亡作用。見(jiàn)圖4。

表2 各組心肌PI3K蛋白表達(dá)

圖2 28 d各組心肌JAK2蛋白表達(dá)免疫組化觀察(DAB，×400)

圖3 各組心肌PI3K蛋白表達(dá)免疫組化觀察(DAB，×400)

圖4 28 d各組心肌細(xì)胞凋亡觀察(TUNEL,×400)

3 討 論

干細(xì)胞動(dòng)員劑可顯著增高外周血干細(xì)胞水平進(jìn)而促進(jìn)骨髓干細(xì)胞向缺血組織歸巢，在心肌微環(huán)境作用下分化為心肌細(xì)胞，改善因缺血缺氧環(huán)境誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和有效收縮單位減少〔5〕。研究表明，活化的PI3K能使下游信號(hào)蛋白絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)發(fā)生磷酸化，進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、遷移、分化和存活〔6〕，同時(shí)PI3K/Akt信號(hào)通路在胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化方面起著重要作用〔7〕，具有抗凋亡、促細(xì)胞存活等功能。JAK是一類非受體酪氨酸激酶家族，JAK的底物為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)，STAT可被JAK磷酸化后發(fā)生二聚化，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)〔8〕。研究表明JAK/STAT途徑對(duì)心肌IRI起著重要作用〔9，10〕，Hwang等〔11〕研究醛糖還原酶過(guò)量表達(dá)，可以激活JAK/STAT途徑，減輕心肌缺血再灌注損傷，而劉勝中等〔12〕則發(fā)現(xiàn)JAK2/STAT3信號(hào)途徑可以減輕細(xì)胞凋亡從而保護(hù)心肌。促紅細(xì)胞生成素(EPO)可以抗凋亡、抗炎，促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)微血管生成〔13〕，同時(shí)EPO顯著增強(qiáng)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的動(dòng)員〔14〕。Kilic等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)EPO可以激活Jak/Stat，PI3k/Akt信號(hào)途徑，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化、抗凋亡作用，保護(hù)缺血心肌。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，心肌IRI其病位在心，涉及血脈，辨證多屬氣虛血瘀，本虛標(biāo)實(shí)。益氣活血方是由丹參飲加味而來(lái)，應(yīng)用中醫(yī)“氣行則血行”的理論，用黃芪補(bǔ)氣培元，扶助心氣；重用丹參活血化瘀入血分；檀香善入氣分；生地黃、當(dāng)歸補(bǔ)虛養(yǎng)血治本。全方補(bǔ)氣活血，通絡(luò)止痛。我們前期研究〔16，17〕表明益氣活血方可以提高CD34+蛋白表達(dá)，促進(jìn)骨髓干細(xì)胞動(dòng)員，同時(shí)可以升高Bax蛋白表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，且益氣活血方可以顯著動(dòng)員自身骨髓干細(xì)胞，從而增加血液中干細(xì)胞數(shù)量，然后促進(jìn)干細(xì)胞歸巢和提高干細(xì)胞定向分化數(shù)量并激活JAK2/STAT3和PI3/AKT信號(hào)途徑，進(jìn)一步通過(guò)激活或抑制其下游靶蛋白，減少細(xì)胞凋亡。

綜上所述，益氣活血方與動(dòng)員骨髓干細(xì)胞相結(jié)合治療心肌IRI具有協(xié)同增效、優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)作用，其機(jī)制之一可能是益氣活血方直接抑制心肌細(xì)胞凋亡或動(dòng)員骨髓干細(xì)胞，影響其歸巢，促進(jìn)干細(xì)胞定向分化，與調(diào)節(jié)JAK2-PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而有抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。