雜交F1代myostatin基因編輯肉牛的肉質(zhì)特性分析

王 鑫，高廣琦，魏著英，白春玲，佟 彬，韓紅燕，張 立，李光鵬

(省部共建草原家畜生殖調(diào)控與繁育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古大學(xué)，呼和浩特，010070)

1 前言

肉質(zhì)的評(píng)價(jià)指標(biāo)有多個(gè)方面，包括pH、肉色、嫩度、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、風(fēng)味等，這些肉質(zhì)性狀主要受遺傳和環(huán)境因素影響[1]。我國(guó)的黃牛在歷史上主要為役用，具有前驅(qū)發(fā)達(dá)、后驅(qū)成流線型、臀部肌肉欠發(fā)達(dá)等特點(diǎn)，生產(chǎn)性能不及國(guó)際上著名的肉牛品種[2]。近年來(lái)，隨著人們對(duì)牛肉需求量的增加，如何改良本地黃牛品種，以提高其產(chǎn)肉性能，是我國(guó)肉牛育種工作的核心任務(wù)之一。多年來(lái)，主要是引進(jìn)國(guó)外優(yōu)良肉牛品種用于本地黃牛的雜交改良，雖然取得了顯著成效[3-5]，但也造成我國(guó)黃牛遺傳種質(zhì)的流失。對(duì)雙肌型比利時(shí)藍(lán)牛(Belgian Blue)和皮埃蒙特牛(Piemontese)的解析，發(fā)現(xiàn)肌肉生長(zhǎng)抑制基因(myostatin，MSTN)是引起雙肌表型的關(guān)鍵基因[6-8]。MSTN基因突變會(huì)使牛產(chǎn)生肌肉過(guò)度發(fā)達(dá)的性狀，從而大幅提高肉牛的屠宰率和產(chǎn)肉率。利用雙肌比利時(shí)藍(lán)公牛與荷斯坦牛雜交后，其后代的活體重、胴體重和屠宰率等顯著高于普通牛的雜交后代[9-10]，但對(duì)于肌肉中脂肪含量和脂肪酸組成，在不同報(bào)道中有差異[9-11]。

為提高魯西黃牛的生長(zhǎng)與產(chǎn)肉性能，利用基因編輯技術(shù)對(duì)其MSTN進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得了雙肌性狀明顯的基因編輯牛[12]。本研究以MSTN基因人工突變魯西黃牛與中國(guó)西門(mén)塔爾牛的雜交F1代為材料，比較分析屠宰和肉質(zhì)性狀，為進(jìn)一步改良牛肉的品質(zhì)、培育高產(chǎn)肉牛新品種提供依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

2.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 本研究所用公牛為經(jīng)鋅指核酸酶技術(shù)編輯的MSTN突變魯西黃牛[12]，以其為父本，以中國(guó)西門(mén)塔爾牛為母本，經(jīng)人工繁育得到F1代牛，對(duì)照組為同齡的中國(guó)西門(mén)塔爾牛。由于純系魯西黃牛的購(gòu)置困難及費(fèi)用等問(wèn)題，本試驗(yàn)并沒(méi)有做基因編輯魯西牛與普通純系魯西牛之間雜交，所用的魯西牛屠宰數(shù)據(jù)來(lái)自《中國(guó)畜禽遺傳資源志-牛志》[13]。所用牛群的生產(chǎn)與飼養(yǎng)管理等均在內(nèi)蒙古內(nèi)大圣牧高科牧業(yè)有限公司基地完成。

2.1.2 儀器設(shè)備 本試驗(yàn)所用儀器包括PH-STAR胴體肉質(zhì)值直測(cè)儀(MATTH?US，德國(guó))、C-LM3B 肌肉嫩度儀(Tenovo，中國(guó))、Tenovo Meat-1 壓肉機(jī)(Tenovo，中國(guó))、B400均質(zhì)儀(Buchi，瑞士)、SERIES 3000近紅外肉質(zhì)分析儀(NIR Technology，澳大利亞)、N-EVAP-111氮吹儀(Organomation，美國(guó))、Centrifuge 5417R冷凍離心機(jī)、Centrifuge 5810R高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))、Precellys 24生物樣品均質(zhì)器(Bertin Technologies，法國(guó))和GCMS-QP2010 SE氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(SHIMADZU，日本)等。

2.1.3 試劑耗材 本試驗(yàn)所用試劑中，氫氧化鉀、甲醇、三氯甲烷為國(guó)產(chǎn)分析純，正己烷為國(guó)產(chǎn)色譜純。脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品為F.A.M.E.Mix, C4-C24100MG NEAT(SUPELCO，美國(guó))。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 育肥與屠宰 本試驗(yàn)共選用8頭公牛，試驗(yàn)組與對(duì)照組各4頭。在同一環(huán)境、常規(guī)飼養(yǎng)管理方式下飼養(yǎng)，待其生長(zhǎng)至24月齡時(shí)，進(jìn)行屠宰。屠宰前禁食24 h，稱(chēng)量活體重；屠宰后，收集各器官組織樣本，稱(chēng)量胴體重，計(jì)算屠宰率(胴體重/活體重×100%)。

胴體于0～4℃、95%濕度條件下，排酸24 h后進(jìn)行分割。分別取每頭牛的上腦、眼肌、米龍與腱子部位肌肉各1 kg左右，現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)排酸后pH值，然后于4℃真空保存樣品，運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，先分裝小塊肉樣于真空條件下保存于-80℃冰箱，其余樣品迅速處理(去除表面結(jié)締組織和肌間脂肪)并完成系水力、剪切力、營(yíng)養(yǎng)成分等檢測(cè)。

2.2.2 pH檢測(cè) 利用PH-STAR檢測(cè)排酸24 h后的肉樣pH值，每個(gè)部位檢測(cè)3次，取平均值。

2.2.3 嫩度檢測(cè) 對(duì)牛肉嫩度的檢測(cè)包括剪切力和系水力兩個(gè)方面。用采樣器平行于肌纖維切下橫截面積為1 cm2的肌肉條，于C-LM3B 肌肉嫩度儀檢測(cè)樣品的剪切力(kg·f)。另取一塊約100 g的樣品，切成方塊，稱(chēng)量初始重量W1，然后用Tenovo Meat-1壓肉機(jī)垂直于肌纖維開(kāi)始擠壓，參數(shù)為默認(rèn)值，儀器停止后用吸水紙吸干表面水分，稱(chēng)量擠壓后重量W2。本研究以失水率(Pressing Loss，PL)反映牛肉樣品的系水力，計(jì)算公式為：PL=(W1-W2)/W1×100%。

2.2.4 營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè) 取約100 g肌肉樣品，用B400均質(zhì)儀攪拌均勻后，于SERIES 3000近紅外肉質(zhì)分析儀中檢測(cè)樣品中水分、脂肪、蛋白的組分，參數(shù)為默認(rèn)值。

2.2.5 脂肪酸檢測(cè) 對(duì)上腦、眼肌、米龍、腱子部位的肌肉樣品，分別取約0.1 g放置于勻漿管中，加入1.5 ml氯仿-甲醇(2:1)溶液，低溫勻漿2 min。在4℃條件下于4 000 r·min-1離心5 min，靜置5 min后，然后吸上清于15 ml離心管中，該過(guò)程重復(fù)兩次以充分提取樣品中的脂類(lèi)。在通風(fēng)條件下，用氮吹儀吹干溶劑，先加入1 ml正己烷，震蕩30 s以加速溶解，再加入1 ml正己烷并震蕩30 s。室溫靜置過(guò)夜后加入1 mL飽和氫氧化鉀-甲醇溶液進(jìn)行甲酯化，劇烈震蕩30 s， 在4℃條件下于4 000 r·min-1離心5 min，吸1ml上清于脂肪酸上樣瓶中，利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)脂肪酸含量。

色譜條件：色譜柱為HP-88高分離度氣相色譜柱(100 m×0.25 mm×0.25 μm， Agilent，美國(guó))；柱箱60℃，進(jìn)樣口 220℃，分流比 20:1；進(jìn)樣量 1 μl；載氣為氦氣，總流量24 ml/min，柱流量 1 ml/min，線速度20 cm/s；升溫程序：初溫60℃，保持1 min，40℃/min升溫至140℃，保持10 min，4℃/min升溫至 240℃，保持15 min。質(zhì)譜條件：離子源溫度 200℃，接口溫度 240℃，溶劑延遲時(shí)間為9.7 min，掃描范圍50～500 m/z。脂肪酸的定性定量分析采用外標(biāo)法。

2.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)，顯著性差異分析采用T-test。

3 結(jié)果與分析

3.1 屠宰性狀

屠宰后，與對(duì)照組牛相比，MSTN雜交F1代牛的各器官的大小與色澤沒(méi)有變化，內(nèi)臟器官周?chē)捌鞴僦g的脂肪分布也沒(méi)有明顯差異。測(cè)量結(jié)果顯示，試驗(yàn)牛平均活體重為653.50±65.16 kg，胴體重392.85±43.90 kg，屠宰率為60.07±1.69%；對(duì)照牛平均體重為632.93±71.12 kg，胴體重346.50±49.36 kg，屠宰率為54.63±2.08%；兩組之間屠宰率具有顯著性差異(P<0.05)(表1)。說(shuō)明MSTN基因編輯牛的雜交F1代的產(chǎn)肉性能顯著提高。與純系魯西黃牛資料數(shù)據(jù)比較[13]，本研究的雜交F1代肉牛的胴體重和屠宰率均明顯提高。

3.2 肉質(zhì)特性

3.2.1 不同部位肌肉的pH 本研究中，試驗(yàn)組和對(duì)照組的上腦、眼肌、米龍、腱子4個(gè)部位牛肉的pH值之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，兩組樣品的pH值都在5.6左右，說(shuō)明MSTN基因突變沒(méi)有影響牛肉的pH值(表2)。

表1 試驗(yàn)牛與對(duì)照牛的屠宰性狀

* 本組數(shù)據(jù)來(lái)自《中國(guó)畜禽遺傳資源志-牛志》，為18～24月齡的魯西公牛[13]

表2 不同部位牛肉的

3.2.3 不同部位肌肉的嫩度 為了進(jìn)一步分析MSTN人工突變牛牛肉的嫩度，分別檢測(cè)了不同部位肌肉的剪切力和系水力。結(jié)果表明，上腦和眼肌的剪切力低于米龍和腱子，壓擠后的失水率也相對(duì)較低，說(shuō)明這兩個(gè)部位肌肉的嫩度較好。試驗(yàn)組牛肉相比于對(duì)照組，剪切力和系水力(失水率)在上腦、眼肌、米龍部位略高，腱子部位略低，然而都沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明不同部位的兩種牛肉嫩度相似(表3)。

表3 不同部位牛肉的嫩度

3.2.4 不同部位肌肉的營(yíng)養(yǎng)成分組成 本研究中，主要對(duì)牛肉中水分、蛋白質(zhì)、脂肪的含量進(jìn)行了測(cè)定。經(jīng)近紅外光譜檢測(cè)得出，牛肉中的水分含量約為70%，蛋白含量約為20%，不同部位的肌內(nèi)脂肪含量為4.7%～10.1%。其中，試驗(yàn)牛和對(duì)照牛的上腦和眼肌的肌內(nèi)脂肪含量較高，說(shuō)明這兩個(gè)部位的牛肉更有利于脂肪的沉積。比較分析發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組4個(gè)部位的牛肉中，肌內(nèi)脂肪含量均低于對(duì)照組，其中上腦和眼肌具有顯著性差異(P<0.05)(圖1)。結(jié)果說(shuō)明MSTN基因突變會(huì)減少F1代牛肌內(nèi)脂肪的沉積。

圖1 不同部位牛肉的營(yíng)養(yǎng)成分組成

3.2.4 不同部位肌肉的脂肪酸組成 為了評(píng)價(jià)肌內(nèi)脂肪的減少是否影響到肉質(zhì)脂肪酸的含量，本研究進(jìn)一步對(duì)肉質(zhì)的脂肪酸組成進(jìn)行了分析。結(jié)果如表4所示，MSTN基因突變牛與對(duì)照牛相比，脂肪酸組成沒(méi)有發(fā)生顯著改變(P>0.05)。不同部位的牛肉中，飽和脂肪酸(Saturated fatty acids，SFA)是最主要的組成部分，為38.05%～51.61%，其中棕櫚酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)含量最高。SFA在腱子的占比少于其它3個(gè)部位，對(duì)于這一結(jié)果，試驗(yàn)組和對(duì)照組有相同的趨勢(shì)。不飽和脂肪酸中，單不飽和脂肪酸(Monounsaturated fatty acid，MUFA)含量較多，主要為棕櫚烯酸(C16:1)和油酸(C18:1n9c)，多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFA)主要為亞油酸(C18:2n)、二十烷三烯酸(C20:3n6、C20:3n3)和花生四烯酸(C20:4n6)。試驗(yàn)牛和對(duì)照牛的眼肌部位PUFA比例低于各自的其它3個(gè)部位。PUFA/SFA比值是評(píng)定肉中脂肪對(duì)人體健康的一個(gè)指標(biāo)，這一比值同樣在眼肌部位最低，在腱子中最高，但在試驗(yàn)組和對(duì)照組相應(yīng)部位的比較中不存在顯著性差異(P>0.05)。

表4 不同部位牛肉中脂肪酸的含量

SFA：飽和脂肪酸；MUFA：?jiǎn)尾伙柡椭舅幔籔UFA：多不飽和脂肪酸；PUFA/SFA：多不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比值

4 討論

4.1 MSTN基因編輯牛的雜交F1代的產(chǎn)肉性能顯著提高

在以提高產(chǎn)肉性能為目的的肉牛育種研究中，往往采用肌肉增長(zhǎng)快的雙肌牛為父本進(jìn)行雜交選育，常用的品種包括比利時(shí)藍(lán)牛、皮埃蒙特牛和超級(jí)夏洛萊牛。Domingo等發(fā)現(xiàn)，10月齡的比利時(shí)藍(lán)?！梁伤固古５耐涝茁士蛇_(dá)59.44±1.22%，顯著高于利木贊×荷斯坦牛(55.17±1.26%)和Rubia Gallega×荷斯坦牛的雜交種(54.86±1.43%)[9]。同樣，Keady等分別利用比利時(shí)藍(lán)牛和安格斯牛與荷斯坦牛雜交，并于299d時(shí)屠宰。結(jié)果顯示，比利時(shí)藍(lán)×荷斯坦雜交牛平均胴體重為369 kg，安格斯×荷斯坦雜交牛平均胴體重為354 kg，二者之間有顯著性差異(P=0.02)[10]。國(guó)內(nèi)學(xué)者的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，比利時(shí)藍(lán)改良 F1 代肉牛屠宰率達(dá)到 69.2%，比本地黃牛屠宰率56.2%提高了13個(gè)百分點(diǎn)，提高幅度達(dá)到 23.1%[14]。另外，用皮埃蒙特公牛對(duì)南陽(yáng)牛[15]、晉南牛[16]、柴達(dá)木本地黃牛[17]、遼育白牛[18]的雜交改良也顯著提高F1代雜交牛的屠宰率。

據(jù)報(bào)道，18～24月齡的純系魯西公牛，其活體重、胴體重和屠宰率分別為512.5±95.5 kg、284.0±52.3 kg和55.4±0.1%；18～22月齡的育肥中國(guó)西門(mén)塔爾閹牛的活體重和屠宰率分別為573.6±69.9 kg和60.4±4.9%[13]。在利用西門(mén)塔爾與魯西牛的雜交試驗(yàn)中，約20月齡的育肥西魯雜交牛屠宰率可達(dá)60.5%～60.96%[19-20]，說(shuō)明西魯雜交牛的生產(chǎn)性能與中國(guó)西門(mén)塔爾牛基本一致。在本研究中，選用了中國(guó)西門(mén)塔爾牛為母本與MSTN基因人工突變魯西牛雜交，MSTN雜交F1代牛的屠宰率既顯著高于純系魯西牛，也高于中國(guó)西門(mén)塔爾牛。說(shuō)明利用MSTN基因編輯魯西黃牛的雜交能夠提高F1代肉牛的生產(chǎn)性能，這一結(jié)果與利用自然突變牛雜交改良的效果是一致的。因此，同MSTN基因自然突變牛一樣，人工突變牛的F1代的生產(chǎn)性能與產(chǎn)肉性能等都顯著提升。另外，本試驗(yàn)所用的基因編輯牛為純種魯西牛，只是將其MSTN基因的一小段堿基刪除了，仍保留魯西牛幾乎完整的基因組，也即保留了魯西牛的遺傳種質(zhì)。

4.2 MSTN基因編輯對(duì)雜交F1代肉牛肌肉的pH值和嫩度的影響

屠宰前牛肌肉的pH值通常為中性，屠宰后在排酸過(guò)程中，由于糖酵解積累乳酸，使pH值下降，能夠減少微生物侵染，有利于肉產(chǎn)品的保存[21]。pH是衡量牛肉品質(zhì)的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，與牛肉系水力和肉色等性狀相關(guān)。屠宰后的牛肉，肌肉內(nèi)糖原酵解速率過(guò)慢會(huì)導(dǎo)致pH過(guò)高，使肌肉顏色變暗，肉質(zhì)表面干硬，形成DFD肉(Dark，F(xiàn)irm，Dry)[22]。相反，如果屠宰后pH降低速率過(guò)快，會(huì)影響肌肉中鈣蛋白酶(Calpain)的活性，降低肉品的系水力，從而導(dǎo)致血水滲出，形成PSE肉(Pale，Soft，Exudative)。本研究中，雜交F1代MSTN基因編輯牛4個(gè)部位牛肉的pH值與對(duì)照牛相比沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，并且pH值在正常范圍內(nèi)(5.6左右)，說(shuō)明MSTN基因突變沒(méi)有影響牛肉的pH值。結(jié)果與比利時(shí)藍(lán)牛雜交對(duì)肉質(zhì)pH值的影響相一致[9]。

作為肉質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一，嫩度與肌纖維和肌纖維相關(guān)蛋白的水解作用有關(guān)[23]。本研究結(jié)果顯示，雜交F1代MSTN基因編輯肉牛不同部位肌肉的剪切力和系水力與對(duì)照牛相比都沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明其肉質(zhì)嫩度沒(méi)有受到影響。有研究表明，雙肌牛牛肉的嫩度偏低，可能是由于肌肉中膠原蛋白含量較少所致[24-25]，然而Wiener等并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)肉質(zhì)的嫩度與MSTN缺失突變存在顯著的相關(guān)性[26]。唐中偉等研究結(jié)果同樣表明，皮埃蒙特雜交F1代牛的肉質(zhì)嫩度與對(duì)照組相近[16]。

4.3 MSTN基因編輯對(duì)雜交F1代肉牛肌肉的肌內(nèi)脂肪和脂肪酸組成的影響

MSTN基因功能的缺失，通常會(huì)導(dǎo)致牛肉肌內(nèi)脂肪含量的減少[27]，這一現(xiàn)象出現(xiàn)在純合突變的比利時(shí)藍(lán)牛[28]及雜合突變的F1代牛中[9, 29]。本研究中，雜交F1代MSTN基因編輯肉牛上腦和眼肌部位的肌內(nèi)脂肪含量顯著低于對(duì)照牛，米龍和腱子部位盡管脂肪含量偏低，但沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明雜交F1代肉牛MSTN基因的突變主要影響肌內(nèi)脂肪在背最長(zhǎng)肌的沉積。低脂肪、高蛋白的牛肉符合當(dāng)今人們追求的健康飲食，然而脂肪低于3%會(huì)影響牛肉的適口性[30]。本文所研究的MSTN基因突變?nèi)馀?，其各部位牛肉的肌?nèi)脂肪含量盡管低于對(duì)照牛，但仍在合理范圍之內(nèi)(大于3%)。

在以往的研究中，MSTN基因自然突變的雙肌牛(MSTN-/-)牛肉含有更高含量的PUFA[26, 28, 31]，可能是由于MSTN基因突變影響到細(xì)胞膜中磷脂的組成，進(jìn)而改變了肌肉中PUFA的含量[27]。然而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用MSTN基因人工突變的肉牛雜交產(chǎn)生的F1代個(gè)體中，PUFA含量以及PUFA/SFA比值與對(duì)照牛相比沒(méi)有顯著差異，這也許是因?yàn)楸狙芯克玫腇1代肉牛的基因型為MSTN雜合突變(MSTN+/-)，在基因調(diào)控上并沒(méi)有完全的失去功能。

5 結(jié)論

魯西黃牛主要產(chǎn)于山東西南部，是我國(guó)役、肉兼用型優(yōu)良品種，但其生長(zhǎng)緩慢、后驅(qū)欠發(fā)達(dá)，經(jīng)濟(jì)效益低于國(guó)際上著名的肉牛品種[32]。中國(guó)西門(mén)塔爾牛是20世紀(jì)50～80年代引進(jìn)的德系、蘇系、奧系西門(mén)塔爾牛與本地黃牛進(jìn)行級(jí)進(jìn)雜交選育而成的乳肉兼用品種，其生產(chǎn)性能和肉質(zhì)通常優(yōu)于純種魯西黃牛[3, 33, 34]。

本研究利用MSTN基因人工突變的魯西黃牛與中國(guó)西門(mén)塔爾牛進(jìn)行繁育，F(xiàn)1代雜交牛表現(xiàn)出優(yōu)于父母本的生產(chǎn)性能，而且肉質(zhì)品質(zhì)沒(méi)有受到影響，表明利用MSTN突變技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)改良國(guó)內(nèi)黃牛的目的。