吊蘭體細胞有絲分裂的制片研究

王昕桐，董宏鑫，劉麗萍

（黑龍江大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱150080）

植物根尖染色體制片技術，是觀察植物體細胞染色體最常用的方法，也是研究染色體組型、染色體分帶、染色體畸變和姊妹染色單體變換的基礎。絕大多數(shù)高等植物是二倍體（diploid），染色體數(shù)目恒定，其根尖細胞會進行有絲分裂，且每天都有分裂高峰定點時間段，植物根尖是觀察染色體最常用的材料。在分裂高峰期取樣并固定根尖，經(jīng)過染色和壓片，在普通光學顯微鏡下觀察，可以看到大量處于有絲分裂各時期的細胞和染色體[1]。

植物細胞有絲分裂有明顯的分裂周期，但其長短不同，通常在十到幾十小時之間。通過預處理可以降低細胞質的粘度，使染色體縮短分散，阻止紡錘體的形成，讓更多的細胞處于分裂中期。細胞分裂中期是染色體形態(tài)觀察和計數(shù)的最佳時期，因此預處理是決定實驗是否成功的關鍵步驟[2]。預處理可用的試劑有很多，例如秋水仙素、對二氯苯、8-羥基喹啉等。解離的目的是分解破壞分生細胞間的果膠質，細胞壁軟化或分解，使細胞和染色體容易分散；利用壓片技術將染色體處理在一個平面，便于形態(tài)、數(shù)量觀察。解離的方法有酸解法和酶解法：酸解法是用鹽酸水解根尖，步驟簡便容易掌握，廣泛應用于染色體計數(shù)、核型分析和染色體畸變的觀察。根尖分生組織經(jīng)過酸解法和壓片后，都呈現(xiàn)單細胞；酶解法常用于染色體顯帶技術或姊妹染色體交換等研究。本實驗使用的是酸解法制片，效果良好。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本課題采用吊蘭根尖為實驗材料，水培吊蘭根尖具有生長快、分生區(qū)明顯、取材方便、二倍體植株，染色體數(shù)量適中等特點，是很好的有絲分裂制片實驗材料。吊蘭（Chlorophytum comosum;bracketplant），百合科多年生常綠草本植物。取水培吊蘭1～3毫米具有分生區(qū)的根尖為實驗材料。

1.2 實驗器具和藥品

1.2.1 用具六孔凹面皿，載玻片，蓋玻片，溫度計，試劑瓶，滴瓶，鑷子，刀片，解剖針，吸水紙。

1.2.2 藥品無水乙醇，70%乙醇，冰乙酸，鹽酸，8-羥基喹啉，堿性品紅，石碳酸，甲醛，山梨醇，中性樹膠，二甲苯。

1.2.3 試劑配制卡諾氏固定液配比：無水乙醇∶冰醋酸=3∶1；離液配比：無水乙醇∶38%鹽酸=1∶1。染色液：配方I，石碳酸品紅（Carbol．fuchsin），先配母液 A和 B。母液A：稱 3克堿性品紅，溶于100毫升的70%酒精中，此液可長期保存；母液B：取母液A 10毫升，加入90毫升的5%石碳酸水溶液，2周內使用。取母液B 45毫升，加入6毫升冰醋酸和6毫升37%的甲醛。此染色液含有較多的甲醛，在植物原生質體培養(yǎng)過程中，觀察細胞核分裂比較適宜。

配方Ⅱ，改良石碳酸品紅：取配方I石碳酸品紅染色液2～10毫升，加入90～98毫升45%的醋酸和1．8克山梨醇（sorbitol）。放置2周后使用染色效果顯著增強，在室溫下不產生沉淀而且比較穩(wěn)定。

1.3 實驗方法

1.3.1 預處理將水培的吊蘭放在25℃左右的環(huán)境中培養(yǎng)，待根長到3cm左右時，分別于8:00、12:00、16:00三個時間段剪下吊蘭根尖，放入0．002mol/L的8-羥基喹啉溶液中，并分組在常溫下分別預處理 2h、3．5h、5h。

1.3.2 材料固定將前期預處理的根尖，現(xiàn)用現(xiàn)配卡諾氏固定液，固定材料15～20min后，如果長期保存可固定24h后轉移到70%乙醇中隨時取用。

1.3.3 解離將固定好的材料水洗2～3次，每次5min。放入現(xiàn)配的解離液（38%濃鹽酸:無水乙醇=1∶1）解離5min。

1.3.4 染色制片 沖洗解離后的材料用蒸餾水反復沖洗2～3次后，用鑷子截取5mm根尖放在清潔的載玻片上。將樣本分為兩組并標記，一組用改良苯酚品紅染液染色5min，另一組用番紅對照染液染色10min。分別加少量染色液，直接將染液滴在載玻片解離好的樣品上，蓋上蓋玻片進行觀察。

1.3.5 鏡檢將玻片標本放在干冰或冰箱凍結，后用雙面刀片迅速把蓋玻片和載玻片分開，滴上中性樹膠或透明指甲油封片，制成永久制片。利用普通光學顯微鏡觀察，10×10倍鏡找到目標細胞后，采用10×40倍鏡觀察染色體。找到不同細胞分裂時期，數(shù)清染色體個數(shù)，拍照保存。

2 結果與分析

2.1 不同采樣時間對實驗的影響

表1 不同采樣時間結果比較

由表1可知，實驗中因取樣時間不同，觀察到的結果差別較大。結果顯示，對于吊蘭根尖染色體的制片，應盡量選擇在上午7:00～9:00取樣。上午的吊蘭根尖處于分裂高峰期，樣本中處于分裂時期的細胞最多，且可以觀察到各個分裂時期的染色體形態(tài)，相較于其他時間段更易于觀察研究。

2.2 不同預處理時間對實驗的影響

8-羥基喹啉預處理可以使較多的根尖染色體處于分裂中期，此時的染色體較為短小，均勻分散在細胞中，易于查清數(shù)目與觀察形態(tài)。實驗選取8:00時樣本預處理結果記錄為表2。

表2 不同預處理時間結果比較

實驗表明，預處理時間不宜過長或過短：過短的預處理時間會使染色體形態(tài)較長，互相交錯纏繞，不易查清染色體個數(shù)；過長的預處理時間使染色體幾乎全部處于中毒狀態(tài)，染色體聚集計數(shù)困難也不易觀察到各個分裂周期的特點與染色體形態(tài)[4]。因此，吊蘭根尖染色體的最佳預處理時間應以3．5～4h 為宜。

2.3 吊蘭各個時期染色體形態(tài)

間期：制片觀察時，間期細胞個數(shù)最多，核膜核仁清晰，有明顯邊緣，此時觀察不到染色體。前期：細胞明顯變大，可以看見一些染色體呈較長螺旋狀的細絲，通過螺旋作用染色體漸漸縮短變粗，隨之染色體形態(tài)也就更加清晰，此時，染色體由兩個染色單體組成，它們在著絲點處相連接，染色體形成的同時核膜核仁消失，這標志著前期終結；中期：染色體較粗，形態(tài)數(shù)目最為清晰，觀察效果最好。由于壓片操作，本應排列在赤道面上的染色體分散開，便于染色體計數(shù)。這一時期細胞中出現(xiàn)紡錘絲，但要仔細觀察才可看到；后期：排列在赤道板上的每個染色體，從著絲點處分開，數(shù)量加倍，分別移向細胞兩極。當每個染色體分開獨立時，每個染色單體就成為一個新染色體，即子染色體；末期：兩組子染色體分別到達兩極后，即末期的開始。紡錘體逐漸消失，染色體已經(jīng)分開呈濃縮狀態(tài)，兩個新核逐漸顯現(xiàn)，細胞拉長，有縊裂趨勢。此時期觀察多個細胞會發(fā)現(xiàn)兩個新核之間會形成細胞板。胞質分裂：明顯觀察到核仁核膜重新出現(xiàn)，新細胞壁將要形成，兩個細胞即將分隔開。

2.4 吊蘭染色體個數(shù)

鏡檢分裂中期細胞，可以清晰的觀察到短粗的染色體，共2n=28條。

3 結論

通過對吊蘭根尖的制片研究，觀察到了前期、中期、后期、末期理想的染色體制片結果，確定吊蘭為二倍體草本植物，且染色體數(shù)是2n=28。7:00～9:00時為吊蘭根尖分生高峰期，此時通過3．5～4h的預處理，酸解法解離，用改良石炭酸品紅滴染5min并進行壓片操作后，可以獲得分裂期完整、分裂相清晰的細胞。

為避免細胞緊貼在一起，制片過程中壓片材料要少，材料多會致使染色體沒有伸展的余地，不利于計數(shù)檢測。溫度明顯影響植物的細胞周期，在特定的溫度下培養(yǎng)植物根尖，便于掌握其有絲分裂高峰期，得到更多的有絲分裂周期顯著特點的細胞。解離后用鑷子敲打蓋玻片時，用力要均勻分布在蓋玻片的每一處，力過大致使細胞過于分散個別染色體丟失，或蓋玻片滑動使細胞卷曲而被迫放棄分裂相良好的細胞。