大陵穴對(duì)大鼠踝部損傷成纖維細(xì)胞修復(fù)的影響※

涂國(guó)卿 鄒來(lái)勇 曹耀興 朱玉輝 李 豐

（江西中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校附屬醫(yī)院針灸科，江西 撫州 344000）

踝關(guān)節(jié)扭挫傷是臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病，導(dǎo)致患部疼痛、瘀腫及功能障礙等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前臨床治療方法多為中草藥外敷，很少有針刺治療者[1]。本研究通過(guò)平衡針刺大陵穴，分析平衡針刺大陵對(duì)踝部軟組織損傷修復(fù)的影響，探索軟組織損傷修復(fù)與成纖維細(xì)胞這一關(guān)鍵的細(xì)胞信號(hào)通路的具體關(guān)系，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及造模 93只體質(zhì)量為 (200±10)g的清潔級(jí)Wistar種大鼠，在相同條件下單籠適應(yīng)性喂養(yǎng)半月后。用10%硫化鈉溶液脫除大鼠左后腿踝部鼠毛，用自制撞擊器 (質(zhì)量120 g)，固定高度，撞擊接觸面（直徑0.4 cm），在大鼠左后腿踝部外側(cè)連續(xù)打擊4次，造成局部軟組織損傷模型。造模成功后將大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、常規(guī)針刺組及平衡針刺組，每組31只。

1.2 動(dòng)物干預(yù)方法

1.2.1 空白對(duì)照組 不進(jìn)行針刺，常規(guī)喂養(yǎng)及觀(guān)察。

1.2.2 常規(guī)針刺組 選取病變部位昆侖、丘墟、解溪、太溪。常規(guī)酒精棉球消毒，采用提插針刺手法，直刺0.2～0.3寸，留針15 min。

1.2.3 平衡針刺組 穴位定位參照李忠仁主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》“常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位”，大陵穴：腕關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)橫紋中心，橈側(cè)腕屈肌腱與指淺屈肌腱之間。根據(jù)“病在左，取之右”及突出單穴療法之原則，都取右側(cè)大陵穴。選用13 mm 0.5寸一次性毫針，常規(guī)酒精棉球消毒，采用提插針刺手法，直刺0.2～0.3寸，以大鼠出現(xiàn)劇烈的抽搐樣表現(xiàn)為宜，快速針刺，快速出針不留針。

以上3組，每天治療1次，連續(xù)治療21 d。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每天觀(guān)察傷肢腫脹和瘀斑等癥侯。

1.3 組織學(xué)檢查 組織學(xué)觀(guān)察評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：6分：軟組織同正常組織；4分：肌纖維腫脹，肌組織內(nèi)瘀血、水腫、出血灶明顯減輕或大部分消失，血管增生，膠原纖維增生，已基本恢復(fù)正常；2分：肌纖維腫脹伴有變性，肌組織內(nèi)瘀血、水腫、出血灶稍有減輕或部分消失，纖維母細(xì)胞侵入，血管增生或膠原纖維增生，與對(duì)照組相比較略有減輕；0分：肌纖維腫脹伴有透明樣變性，肌纖維明顯壞死，肌纖維組織內(nèi)伴有嚴(yán)重瘀血、水腫、出血。

1.4 成纖維細(xì)胞免疫組織化學(xué)檢測(cè) 于術(shù)后21 d處死大鼠，并取損傷處瘢痕的軟組織，體積分?jǐn)?shù)為4%的甲醛固定，乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，將蠟塊標(biāo)木切成5 μm厚的石蠟切片，對(duì)石蠟切片脫蠟后行蘇木精-伊紅染色，并在光鏡下進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀(guān)察。

免疫組織化學(xué)檢測(cè):采用鏈霉親和素-過(guò)氧化酶連接法 (SP法)檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原。二甲苯脫蠟，乙醇逐級(jí) (體積分?jǐn)?shù)為100%→體積分?jǐn)?shù)為95%→體積分?jǐn)?shù)為80%→體積分?jǐn)?shù)為70%)至自然水化，蒸餾水洗；采用0.01 mol/L構(gòu)椽酸鈉緩沖溶液，高溫高壓修復(fù)抗原；蒸餾水洗，PBS 5 min沖洗3次；體積分?jǐn)?shù)為3%的H202阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min，PBS 5 min沖洗3次；滴加適當(dāng)比例稀釋的增殖細(xì)胞核抗原單克隆抗體，4℃過(guò)夜；PBS 5 min沖洗3次，滴加山羊抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體，37℃孵育40 min；PBS 5 min沖洗3次，DAB顯色液；蘇木精液復(fù)染細(xì)胞核1 min，體積分?jǐn)?shù)為95%、體積分?jǐn)?shù)為100%的乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。每批染片均有已知陽(yáng)性同一蠟塊作陽(yáng)性對(duì)照，及PBS為一抗做陰性對(duì)照。細(xì)胞核呈黃色或棕黃色者為陽(yáng)性。在顯微鏡下每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野 (每個(gè)視野中至少200個(gè)細(xì)胞)，計(jì)數(shù)增殖細(xì)胞和正常細(xì)胞數(shù)目，按公式：增殖指數(shù) (%)=增殖細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%計(jì)算增殖細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例，并計(jì)算出平均增殖指數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 （±s）表示，結(jié)果以P<0.05為差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀(guān)察評(píng)分 結(jié)果顯示：治療前各組評(píng)分比較無(wú)明顯差異（P>0.05）；治療前后各組比較，平衡針刺組有顯著性差異（P<0.01），常規(guī)針刺組有顯著性差異（P<0.05），空白對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異（P>0.05）；治療后各組比較，平衡針刺組與常規(guī)針刺組及空白對(duì)照組比較都有顯著性差異（P<0.01），常規(guī)針刺組與空白對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P>0.05） （見(jiàn)表1）。

表1 3組治療前后組織學(xué)評(píng)分 （±s，分）

表1 3組治療前后組織學(xué)評(píng)分 （±s，分）

注：治療前各組比較，1）P>0.05。治療前后各組比較，平衡針刺組，2）P<0.01；常規(guī)針刺組，3）P<0.05；空白對(duì)照組，4）P>0.05。治療后各組比較，平衡針刺組與常規(guī)針刺組及空白對(duì)照組，5）P<0.01；常規(guī)針刺組與空白對(duì)照組，6）P>0.05

組別 只數(shù) 治療前 治療后平衡針刺組 31 0.50±0.061) 3.2±0.32）5）常規(guī)針刺組 31 0.52±0.03 0.7±0.43）6）空白對(duì)照組 31 0.51±0.05 0.61±0.34）

2.2 組織形態(tài)學(xué)觀(guān)察 伊紅染色結(jié)果顯示，平衡針刺組治療組成纖維細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，呈梭形，其細(xì)胞核為卵圓形，位于細(xì)胞中央，數(shù)量多。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，成纖維細(xì)胞表達(dá)為陽(yáng)性；常規(guī)針刺組成纖維細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則，呈梭形，其細(xì)胞核為卵圓形，位于細(xì)胞中央，數(shù)量一般，成纖維細(xì)胞表達(dá)為陽(yáng)性；空白對(duì)照組成纖維細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，其細(xì)胞核為卵圓形，位于細(xì)胞一側(cè)，數(shù)量較少，成纖維細(xì)胞表達(dá)為弱陽(yáng)性。

2.3 成纖維細(xì)胞增殖指數(shù) 0～6 d各組增殖較緩慢，3組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)均呈平緩上升趨勢(shì)；7～9 d細(xì)胞的增殖速度加快，從9 d開(kāi)始平衡針刺組 (系列1）的增殖速度明顯高于常規(guī)針刺組（系列2）與空白對(duì)照組（系列3），第21天，3組增殖速度達(dá)到峰值，平衡針刺組的增殖速度明顯高于其他2組。見(jiàn)圖1。

圖1 成纖維細(xì)胞增殖指數(shù)

3 討論

踝關(guān)節(jié)扭傷屬中醫(yī)學(xué)“筋痹”“痹癥”范疇，是由于外傷因素，使踝部的經(jīng)脈受損，氣血運(yùn)行不暢，經(jīng)絡(luò)不通，氣滯血瘀而致[2]。制定便捷、合理、高效的治療方案是未來(lái)的研究趨勢(shì)，最大限度恢復(fù)運(yùn)動(dòng)功能、降低并發(fā)癥發(fā)生率是未來(lái)研究的最終目標(biāo)[3]。其主要表現(xiàn)為踝關(guān)節(jié)腫脹、疼痛，局部瘀斑和功能障礙等，如處理不及時(shí)或不當(dāng)，常常遺留踝關(guān)節(jié)不穩(wěn)及后期創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎。針刺治療軟組織損傷可提高痛閾，減輕局部炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)，從而起到緩解疼痛、減輕腫脹的作用[4-5]。目前有腧穴與腦功能特定聯(lián)系、針灸鎮(zhèn)痛機(jī)制[6]等方面相關(guān)研究的報(bào)道。

根據(jù)《靈樞·官針》：“巨刺者，左取右，右取左”，《靈樞·終始》：“病在下者，高取之”，故獨(dú)取健側(cè)大陵穴。大陵穴，是臨床上常用的特定穴，屬手厥陰心包經(jīng)，為手厥陰心包經(jīng)之輸穴、原穴。大陵穴位于腕掌側(cè)橫紋頭之中點(diǎn)，橈側(cè)腕屈肌腱與掌長(zhǎng)肌之間的凹陷處，為手厥陰心包經(jīng)之原穴，因其在五輸穴中為輸穴，屬土，據(jù)其“輸”主體重節(jié)痛的理論，此穴還具有理氣止痛、舒筋活絡(luò)、祛風(fēng)止痹的作用。大陵是心包經(jīng)的輸穴、原穴，與三焦經(jīng)相表里，在王文遠(yuǎn)教授的平衡穴位里稱(chēng)為踝痛穴，能治療小腿、踝關(guān)節(jié)及足底疼痛等病變；在名醫(yī)李柏松先生的“八字治療法”中大陵穴為治療踝關(guān)節(jié)疼痛的反應(yīng)點(diǎn)。在治療方面臨床取用原穴能使三焦原氣通達(dá)，從而激發(fā)原氣，調(diào)動(dòng)體內(nèi)的正氣以抗御病邪，有研究[7]認(rèn)為針刺大陵穴能促進(jìn)血管舒張，故巨刺大陵穴可行氣活血、化瘀通絡(luò)、消腫止痛。研究表明[8]：針刺大陵穴則可能更傾向于對(duì)自主神經(jīng)及客觀(guān)語(yǔ)言等非主觀(guān)因素產(chǎn)生影響。

“平衡針刺法”是在繼承傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)上，吸收現(xiàn)代科學(xué)理論而發(fā)展起來(lái)的一門(mén)現(xiàn)代針灸學(xué)。平衡針刺采取遠(yuǎn)距離取穴，即“病在上，取之下；病在下，取之上；病在左，取之右；病在右，取之左”；突出單穴療法，原則上是一病一穴，一癥一穴；突出快速針刺亦稱(chēng)三快針?lè)?，即進(jìn)針快、找針感快、出針快，整個(gè)針刺過(guò)程控制在3 s之內(nèi)；突出即時(shí)效應(yīng)亦稱(chēng)一針見(jiàn)效。平衡針刺具有取穴少、療效好、安全價(jià)廉，突出安全、突出有效、突出簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，充分地發(fā)揮了機(jī)體自身調(diào)節(jié)平衡的獨(dú)立性，同時(shí)產(chǎn)生異向思維，采用頭痛醫(yī)腳，腳痛醫(yī)手的平衡取穴方法。涂國(guó)卿[9]采用“整體平衡療法” (平衡針刺法加平衡推拿法)治療腰椎間盤(pán)突出癥，并與常規(guī)針刺和推拿方法對(duì)比，觀(guān)察兩者鎮(zhèn)痛效果與鎮(zhèn)痛時(shí)效，表明“整體平衡療法”對(duì)比傳統(tǒng)針刺和推拿療法治療腰椎間盤(pán)突出癥具有更好的鎮(zhèn)痛效果，體現(xiàn)了中醫(yī)整體觀(guān)的優(yōu)越性。韓笑[10]采取平衡針腰痛穴對(duì)比傳統(tǒng)針刺治療腰椎間盤(pán)突出癥，結(jié)果：2組治療后比較，疼痛改善率及疼痛分級(jí)指數(shù)總分、視覺(jué)模擬量表評(píng)分、現(xiàn)時(shí)疼痛狀況，平衡針組略顯優(yōu)勢(shì)，既體現(xiàn)在即時(shí)效果，也表現(xiàn)在遠(yuǎn)期療效方面 (P<0.05)。結(jié)論：平衡針能很好地改善腰椎間盤(pán)突出癥的疼痛癥狀，既有即時(shí)效果，也有遠(yuǎn)期療效。

成纖維細(xì)胞 (fibroblast，F(xiàn)B)是主要的軟組織損傷修復(fù)細(xì)胞，它是高度異型的間充質(zhì)細(xì)胞，是疏松結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分，細(xì)胞呈梭形或扁的星狀，具有突起，也是致密結(jié)締組織如肌腱、韌帶分泌膠原的主要細(xì)胞。成纖維細(xì)胞可以分泌多種生長(zhǎng)因子 (如TGF-b， PDGF， bFGF)、激素 (如IGF-I，IGF-II)及細(xì)胞素(如IL-1，TNF-a）。成纖維細(xì)胞能夠維持各種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞素、基質(zhì)金屬蛋白酶及金屬蛋白酶組織抑制因子的合成與分解平衡。因此Lekic等[11]認(rèn)為，它是創(chuàng)傷修復(fù)的工程師、建筑者和管理員。了解與控制FB的生物學(xué)行為是促進(jìn)軟組織損傷修復(fù)、創(chuàng)傷愈合、預(yù)防瘢痕形成的基礎(chǔ)與關(guān)鍵[12]。FB在軟組織損傷修復(fù)過(guò)程中的作用是極為重要的。它的增殖及凋亡將影響著各種生長(zhǎng)因子及基質(zhì)的合成及釋放，影響著肉芽組織及瘢痕粘連的形成。在組織損傷修復(fù)的不同時(shí)期，F(xiàn)B的增殖與凋亡都有不同的意義[13]。關(guān)于FB對(duì)軟組織損傷修復(fù)中作用的研究日益深入，但人多數(shù)是關(guān)于皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的研究，從FB對(duì)肌肉、肌腿、韌帶、筋膜等組織的損傷修復(fù)角度研究的卻不多，但FB在這些組織損傷中的修復(fù)過(guò)程及機(jī)制是基本一致的。

本研究顯示：治療前后各組組織學(xué)評(píng)分比較，平衡針刺組有顯著性差異，常規(guī)針刺組有顯著性差異，空白對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異；治療后各組比較，平衡針刺組與常規(guī)針刺組及空白對(duì)照組比較都有顯著性差異；平衡針刺組治療組成纖維細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，呈梭形，其細(xì)胞核為卵圓形，位于細(xì)胞中央，數(shù)量最多。成纖維細(xì)胞表達(dá)為陽(yáng)性，治療結(jié)束后3組成纖維細(xì)胞增殖速度達(dá)到峰值，平衡針刺組的增殖速度明顯高于其他2組。說(shuō)明平衡針刺能較好地調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的表達(dá)，增加其數(shù)量，能更好地修復(fù)損失組織，達(dá)到較好的治療效果。