山西老陳醋釀造過(guò)程中川芎嗪的分析測(cè)定

鞏麗青，韓順林，趙芳，張勝利，古建宇，范麗華

(1.晉中市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試所，山西 晉中 030600；2.晉中市食品藥品稽查隊(duì)，山西 晉中 030600)

山西老陳醋是我國(guó)四大名醋之一，迄今為止已有300多年的歷史，以色、香、醇、濃、酸五大特征著稱于世，素有“天下第一醋”的盛譽(yù)[1]。山西老陳醋不僅是人們生活必需的調(diào)味品，而且是一種保健養(yǎng)生食品，具有調(diào)節(jié)血糖血脂[2,3]、降低血壓[4]的功效。

GB/T 19777-2013《地理標(biāo)志產(chǎn)品 山西老陳醋》[5]增加了川芎嗪、總黃酮等特征指標(biāo)。川芎嗪(Tetramethylpyrazine，TMP)即四甲基吡嗪，主要存在于傘形科植物川芎根莖、姜科植物溫莪術(shù)根莖，據(jù)試驗(yàn)表明，川芎嗪是治療血栓等疾病的新型藥物，有抗血小板凝集、擴(kuò)張小動(dòng)脈、改善微循環(huán)和活血化瘀的作用，并對(duì)已聚集的血小板有解離作用。山西老陳醋中的川芎嗪這一特征指標(biāo)賦予了老陳醋降血壓、活血化瘀和清除自由基的保健價(jià)值[6]。本文采用高效液相色譜法對(duì)山西老陳醋傳統(tǒng)生產(chǎn)過(guò)程中的川芎嗪含量進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其生成規(guī)律，為山西老陳醋生產(chǎn)工藝的優(yōu)化，增加特征指標(biāo)的含量，提升山西老陳醋的附加值提供了技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)方法

1.1 主要材料與試劑

采集山西老陳醋傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝過(guò)程中不同階段的樣品(由山西陳世家釀業(yè)有限責(zé)任公司提供)；鹽酸川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)品；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純；試驗(yàn)用水為重蒸水，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters型高效液相色譜儀(UPLC系列，PDA檢測(cè)器，C18，2.1 mm×50 mm，1.7 μm) 美國(guó)Waters公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

準(zhǔn)確量取待測(cè)樣品10.00 mL，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH>8.0，入分液漏斗，加三氯甲烷5 mL，混勻萃取，重復(fù)上述加入三氯甲烷以后的操作，合并三氯甲烷層。以0.2 mol/L鹽酸分2次萃取三氯甲烷相，每次4.5 mL，合并水相，用重蒸水定容至10.00 mL，0.45 μm濾膜過(guò)濾備用。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：0.2 mmol/L 磷酸二氫銨∶色譜甲醇為6∶4；流速：0.8 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：3 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：279 nm。

1.3.3 鹽酸川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取50.00 mg鹽酸川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)品，用重蒸水定容至50 mL。

1.3.4 鹽酸川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取鹽酸川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05，0.10，0.25，0.50，1.00 mL，用重蒸水定容至10 mL (相當(dāng)于每1 mL含鹽酸川芎嗪 5.0，10.0，25.0，50.0，100.0 μg)，分別進(jìn)樣3 μL，于279 nm處測(cè)量峰面積，每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣3次，取平均值。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積平均值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

川芎嗪質(zhì)量濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 川芎嗪標(biāo)準(zhǔn)曲線

回歸方程為：Y=2492.8X-3281.1(R2=0.9999)。

式中：X為川芎嗪質(zhì)量濃度，μg/mL；Y為響應(yīng)的色譜峰面積。

1.3.5 試樣測(cè)定

取處理好的試樣3 μL注入液相色譜儀，計(jì)算出樣品中川芎嗪的含量。

1.3.6 結(jié)果計(jì)算

式中：X為樣品中川芎嗪含量，mg/L；C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的樣液中川芎嗪的質(zhì)量濃度，μg/mL；V1為分析所取試樣體積，mL；V2為試樣最后定容體積，mL。

2 結(jié)果分析

2.1 酒精發(fā)酵階段川芎嗪含量

在山西老陳醋的傳統(tǒng)發(fā)酵工藝中，酒精發(fā)酵周期為16天，在第16天酒精發(fā)酵結(jié)束后取樣10個(gè)，用0.45 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣檢測(cè)，樣品中均未檢測(cè)出川芎嗪。

2.2 醋酸發(fā)酵階段川芎嗪含量

在地理標(biāo)志產(chǎn)品山西老陳醋的釀造工藝中，醋酸發(fā)酵周期為10天，分別取醋酸發(fā)酵第1，2，3，4，5，6，7，8，9，10天的樣品，測(cè)定其川芎嗪含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 醋酸發(fā)酵階段川芎嗪含量

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，繪制樣本1和樣本2樣品中川芎嗪含量圖，見(jiàn)圖2。

圖2 醋酸發(fā)酵階段樣品1與樣品2中川芎嗪含量

由圖2可知，川芎嗪最早產(chǎn)生于醋酸發(fā)酵階段，且隨著醋酸濃度的升高而緩慢增加，其濃度極低；不同生產(chǎn)批次的樣本中川芎嗪含量也不盡相同，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，2個(gè)樣本均值無(wú)顯著性差異，分析川芎嗪生成規(guī)律可以看出，在醋酸發(fā)酵期間川芎嗪增加較為緩慢。

2.3 熏醅階段川芎嗪含量

熏醅工藝是山西老陳醋傳統(tǒng)工藝的精華之一，是山西老陳醋色、香、體、味的主要來(lái)源[7]，可使山西老陳醋的酯香、熏香有機(jī)復(fù)合，同時(shí)無(wú)需添加調(diào)色劑就有理想的色澤[8]，熏醅周期5天，跟蹤醋酸發(fā)酵結(jié)束后的同批樣品，逐天采樣，處理方法同醋酸發(fā)酵階段，測(cè)定川芎嗪含量，見(jiàn)表2。

表2 熏醅階段川芎嗪含量

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，繪制樣本1和樣本2樣品中川芎嗪含量圖，見(jiàn)圖3。

圖3 熏醅階段樣品1與樣品2中川芎嗪含量

通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，在熏醅階段，樣本1與樣本2的川芎嗪含量無(wú)顯著性差異，并且都有明顯的增加，說(shuō)明在熏醅階段發(fā)生的生化反應(yīng)有利于川芎嗪的生成。

2.4 淋醋及陳釀階段川芎嗪含量

取當(dāng)日新淋的醋樣，入缸存放，每隔20天測(cè)定川芎嗪含量，陳釀階段川芎嗪含量見(jiàn)表3。

表3 陳釀階段川芎嗪含量

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，繪制樣本1和樣本2樣品中川芎嗪含量圖，見(jiàn)圖4。

圖4 陳釀階段樣品1與樣品2中川芎嗪含量

由圖4可知，在陳釀階段，川芎嗪含量上升趨勢(shì)較明顯，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，樣品的川芎嗪含量從陳釀前的45 μg/mL增加到了150 μg/mL，增加約3倍之多。這一階段川芎嗪含量增加較熏醅階段趨于緩和，但也較為明顯，因此老陳醋的陳釀時(shí)間也是川芎嗪產(chǎn)生的主要原因之一[9,10]。

結(jié)合陳釀的工藝特色分析其產(chǎn)生原因，陳釀的“夏伏曬”、“冬撈冰”過(guò)程會(huì)大幅降低老陳醋中的水分和其他揮發(fā)性物質(zhì)，導(dǎo)致食醋濃度增加，這也是川芎嗪含量上升的原因之一[11]。

3 結(jié)論與討論

川芎嗪是地理標(biāo)志產(chǎn)品山西老陳醋的特征指標(biāo)之一。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)地理標(biāo)志產(chǎn)品山西老陳醋釀造過(guò)程中川芎嗪的分析測(cè)定，發(fā)現(xiàn)川芎嗪最早產(chǎn)生于醋酸發(fā)酵階段，但是含量極低；在熏醅階段，川芎嗪含量有非常明顯的上升趨勢(shì)，且在老陳醋陳釀過(guò)程中，川芎嗪含量隨著陳釀時(shí)間的增加而增加。

我們還需進(jìn)一步探索老陳醋釀造過(guò)程中發(fā)生的生化反應(yīng)及此過(guò)程中相關(guān)微生物對(duì)川芎嗪產(chǎn)生的積極作用，為提高山西老陳醋的附加值及研究富含川芎嗪的山西老陳醋提供技術(shù)支撐。