辛香料植物貫葉馬兜鈴的根及葉揮發(fā)性成分分析及其食用風(fēng)險(xiǎn)解析

陳高，葛佳，秦燕，孫衛(wèi)邦

(1.云南省極小種群野生植物綜合保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650204；2.中國(guó)科學(xué)院東亞植物多樣性與生物地理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650204；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4.云南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650204)

辛香料植物在人民的飲食生活中扮演著重要角色，在世界范圍內(nèi)已經(jīng)有上千年的使用歷史[1]。這些香味成分被用來提升食物的顏色、芳香以及風(fēng)味[2]。在東方國(guó)家，特別是中國(guó)，蔥、蒜、姜、辣椒、胡椒、芫荽、五香八角、桂皮等均為傳統(tǒng)的辛香料食用材料來源，有深厚的民間基礎(chǔ)[3]。雖然辛香料植物能增加食物的風(fēng)味，但有些成分具有潛在的風(fēng)險(xiǎn)，比如香樟中的黃樟素，魚腥草中的、杜衡、細(xì)辛、馬兜鈴等已經(jīng)被國(guó)際上的相關(guān)研究機(jī)構(gòu)指明需謹(jǐn)慎使用[4,5]?？紤]到中國(guó)的傳統(tǒng)食用藥材和食材通常添加辛香料增加風(fēng)味，我們建議應(yīng)該謹(jǐn)慎使用這些傳統(tǒng)的、但沒有經(jīng)過詳細(xì)評(píng)估的食用或藥用原材料，以防止慢性中毒。

貫葉馬兜鈴(AristolochiadelavayiFranch.)，因其全株具有酷似姜科植物草果的濃郁辛香味，也稱山草果。該植相似物主產(chǎn)于滇西北及川西金沙江干熱和干暖河谷1580～2500 m之間(見圖1)[6]。該物種是我國(guó)馬兜鈴科馬兜鈴屬的特有植物[7]。當(dāng)?shù)鼐用袷褂秘炄~馬兜鈴的干燥葉當(dāng)作烹調(diào)的香料，被廣泛加在食物里以增加風(fēng)味，且能夠有效去除牛、羊、魚的膻味和腥味，在民間已有很長(zhǎng)的食用歷史[8]。此外，當(dāng)?shù)厝藗冞€利用其葉作健胃、增進(jìn)食欲和治療感冒、瘧疾和牙痛的常備藥。目前，由于分布范圍有限，且被長(zhǎng)期挖掘，該物種的野外居群受到嚴(yán)重的破壞，已被IUCN紅色目錄列為瀕危物種。

最近研究發(fā)現(xiàn)貫葉馬兜鈴是一種易危麝鳳蝶屬昆蟲幼蟲的特異寄主，其取食葉片以獲得防御天敵的馬兜鈴酸，見圖 1。

圖1 貫葉馬兜鈴及其特異寄主達(dá)摩麝鳳蝶Fig.1Aristolochia delavayiand its parasitical insectByasa daemonius

注：a為貫葉馬兜鈴在金沙江干熱河谷的植株和生境；b為葉上釋放辛香味的腺毛； c為未成熟果實(shí)；d為當(dāng)?shù)劁N售的盒裝干燥地上部分產(chǎn)品；e為達(dá)摩麝鳳蝶的卵；f為幼蟲；g為蛹；h為成蟲。

目前，馬兜鈴科馬兜鈴屬和細(xì)辛屬植物的馬兜鈴酸I 和II(AAs)導(dǎo)致的腎衰竭、尿毒癥、肝毒性的安全隱患得到了廣泛的關(guān)注[9]。馬兜鈴屬的草藥也被國(guó)際癌癥研究機(jī)制列為對(duì)人類有強(qiáng)致癌潛力的物質(zhì)(Agency for Research on Cancer，2002)。在馬兜鈴酸的同系物中，馬兜鈴酸I和II成分誘導(dǎo)細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生突變，這些成分能直接引起腎小管細(xì)胞的破壞[10]。雖然科研人員、政府工作人員、城市居民可能知道馬兜鈴酸和馬兜鈴腎病的關(guān)系(Aristolochic Acid Nephropathy,AAN)，但生活在偏遠(yuǎn)地區(qū)的居民可能并不熟悉AAN，因此貫葉馬兜鈴仍在滇西北市場(chǎng)廣泛銷售。

以前的研究報(bào)道貫葉馬兜鈴精油中具有濃郁辛香味的成分是反式-2-十一碳烯醛，而這種成分在山草果中含量竟高達(dá)94.2%，大大超過了其在草果中的含量。但上述研究均為水蒸氣蒸餾獲得的精油，且研究結(jié)果和其后的結(jié)果不一致，因?yàn)榭┤┛赡懿攀秦炄~馬兜鈴精油的主成分[11]。我們?cè)谡{(diào)查該物種受威脅的情況時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)厣鐓^(qū)居民通常將該植物的全株陰干，然后將干燥的葉搓成粉末撒在食物上。因此，我們認(rèn)為直接用動(dòng)態(tài)頂空吸附的方法收集的氣味，才能真正代表當(dāng)?shù)鼐用裣矚g貫葉馬兜鈴的揮發(fā)性氣味。分析這些材料的馬兜鈴酸才能弄清當(dāng)?shù)鼐用袷秤迷撝参飼r(shí)的馬兜鈴酸攝入量。

本研究按照當(dāng)?shù)鼐用竦氖秤昧?xí)慣，以動(dòng)態(tài)頂空吸附與GC-MS聯(lián)用分析貫葉馬兜鈴干燥葉和根自然釋放的揮發(fā)性成分，擬探討如下問題：自然條件下貫葉馬兜鈴葉和根釋放的揮發(fā)性辛香成分和組成比例；自然揮發(fā)物和以前水蒸氣蒸餾提取的精油成分的組成和比例是否存在差異；通過對(duì)貫葉馬兜鈴葉和根揮發(fā)性成分的分析，結(jié)合貫葉馬兜鈴的馬兜鈴酸含量，在弄清食用貫葉馬兜鈴的芳香成分的同時(shí)，對(duì)馬兜鈴酸的攝入量進(jìn)行評(píng)估，以期為當(dāng)?shù)鼐用竦慕】蛋踩峁﹨⒖迹矠楸Ｗo(hù)貫葉馬兜鈴和達(dá)摩麝鳳蝶受威脅的生態(tài)關(guān)系提供科學(xué)建議。

1 材料和方法

貫葉馬兜鈴的干燥葉及根材料直接采集于金沙江下虎跳三壩鄉(xiāng)江邊村哈夢(mèng)龍客棧老板家的庫(kù)存干物質(zhì)(27°18.865′ N，100°13.679′ E, 1972 m)。模式標(biāo)本保存于中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所的標(biāo)本館(KUN)。貫葉馬兜鈴的葉及根的自然揮發(fā)性成分收集裝置為動(dòng)態(tài)頂空吸附，具體的操作流程參見我們以前的研究方法[12]。將自然干燥的貫葉馬兜鈴的葉3 g放于體積為2 L的干燥器中，并用無氣味的封口膜(Pechiney, Parafilm, WI 54952)包裹好，以防止外來的氣味干擾葉本身的氣味。環(huán)境中的空氣經(jīng)活性炭(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)吸附凈化后通過聚四氟乙烯管導(dǎo)入內(nèi)放貫葉馬兜鈴干燥葉粉末材料的密封玻璃罩，并用流量計(jì)(常州市成豐流量?jī)x表有限公司)和閥門控制進(jìn)氣速度。混合貫葉馬兜鈴辛香氣味的空氣通過Porapak Q吸附管(Enka Research Institute Arnhem; 60/80目)后由抽氣泵(武漢市天聯(lián)科教儀器發(fā)展有限公司)釋放到環(huán)境中。流量計(jì)的流量設(shè)計(jì)為400 mL/min，抽氣3 h。吸附結(jié)束后用500 μL重蒸正己烷反復(fù)洗脫吸附管3～4次，并加入3000 ng正壬烷作為內(nèi)標(biāo)，提取液直接上GC和GC-MS儀分析洗脫液成分和組成比例。為確定揮發(fā)性成分的穩(wěn)定性，取不同植株的根和葉各進(jìn)行4次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

氣相色譜條件：儀器為美國(guó)Agilent Technologies公司的HP5890.HP-5石英毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；柱溫起始為40 ℃，保持5 min，程序升溫5 ℃/min，至280 ℃；柱流量為1.5 mL/min；進(jìn)樣溫度250 ℃；氫火焰檢測(cè)溫度250 ℃；進(jìn)樣量0.3 μL；分流比50∶1；載氣為高純氮?dú)?。氣相色譜-質(zhì)譜條件：儀器為美國(guó)Agilent Technologies 公司的HP6890GC/5973MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。GC條件：HP-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱溫起始為40 ℃，保持5 min，程序升溫5 ℃/min，至280 ℃；柱流量為1.0 mL/min；進(jìn)樣溫度250 ℃；柱前壓100 kPa；進(jìn)樣量1.0 μL；分流比10∶1；載氣為高純氦氣。MS條件：電離方式EI；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；質(zhì)量范圍35～500；采用Wiley7n.1譜庫(kù)檢索定性確認(rèn)密蒙花揮發(fā)性化學(xué)成分，按照峰面積歸一化法計(jì)算出各化學(xué)成分的峰面積相對(duì)百分含量，并用正壬烷定量植物的自然釋放量，同時(shí)用標(biāo)注品確認(rèn)主成分反式-2-葵烯醛的真實(shí)性。

馬兜鈴酸的含量高低、使用頻率及其攝入量和其毒性密切相關(guān)，我們最近的研究已經(jīng)弄清下虎跳居民食用的貫葉馬兜鈴所含的馬兜鈴酸I和II的含量組成情況。馬兜鈴酸I和II在干燥葉、果和根中的含量分別為5.5，456.5，1680.4 μg/g。馬兜鈴酸II在干燥葉、果和根中的含量分別為55.4，192.7，980.6 μg/g。因此，本次我們僅從社區(qū)調(diào)查的角度了解當(dāng)?shù)鼐用駥?duì)食用貫葉馬兜鈴的習(xí)慣是否會(huì)因?yàn)槲覀兊目破招麄鞫兴淖?。我們?duì)下虎跳江邊村永殼社區(qū)的56個(gè)住戶的137個(gè)成年人(63女，74男)進(jìn)行訪談，詢問他們食用貫葉馬兜鈴的劑量、使用頻率并告知他們食用貫葉馬兜鈴可能帶來的健康安全隱患。對(duì)所獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以期指導(dǎo)社區(qū)居民正確對(duì)待有爭(zhēng)議的馬兜鈴科植物帶來的馬兜鈴酸腎病或肝病問題。

2 結(jié)果與分析

本研究從貫葉馬兜鈴的根和葉中共檢出29個(gè)化合物。從貫葉馬兜鈴葉中鑒定出19個(gè)揮發(fā)性成分，占揮發(fā)性成分總量的97.8%，其中反式-2-葵烯醛(79.79%)、3-十二烯醛(4.26%)、辛醛(2.49%)、反式-2-己烯醛(2.09%)和葵醛(1.80%)為主要成分。從貫葉馬兜鈴根中分離出16個(gè)揮發(fā)性成分，占揮發(fā)性成分總量的98.2%，其中乙酸龍腦酯(37.08%)、尼泊金丙酯(22.29%)、1,3,8-p-孟三烯(19.93%)、莰烯(6.39%)和β-蒎烯(2.21%)為主要成分，更多的細(xì)節(jié)見表1。

表1 貫葉馬兜鈴葉及根的揮發(fā)性化學(xué)成分組成Table 1 The volatile chemical constituents from leaves and roots ofAristolochia delavayi

續(xù) 表

我們最近的研究揭示貫葉馬兜鈴中的馬兜鈴酸Ⅰ和Ⅱ及其同系物在該物種中普遍存在，馬兜鈴酸Ⅰ和Ⅱ在根、葉和果實(shí)中的變化及在達(dá)摩麝鳳蝶不同階段的積累程度也各有不同。就《中國(guó)藥典》2010版本規(guī)定細(xì)辛中馬兜鈴酸的使用標(biāo)準(zhǔn)來看，馬兜鈴酸I的含量不應(yīng)該超過干物質(zhì)的0.001%(10 μg/g)，同時(shí)藥典也提醒注意馬兜鈴酸可能的腎毒性風(fēng)險(xiǎn)。就我們的研究來看，馬兜鈴酸I的含量在貫葉馬兜鈴干燥葉、果和根中的含量分別為5.5，456.5，1680.4 μg/g。果實(shí)和根中的馬兜鈴酸I都遠(yuǎn)超藥典的規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。但葉片中的馬兜鈴酸I的含量低于10 μg/g的國(guó)家規(guī)定水平的最高上限。

我們對(duì)137個(gè)成年人的調(diào)查發(fā)現(xiàn)有11人(8.03%)認(rèn)為食用貫葉馬兜鈴沒有健康風(fēng)險(xiǎn)，他們會(huì)繼續(xù)食用，有7人(5.11%)堅(jiān)決表示他們以后再也不食用添加貫葉馬兜鈴材料的食物，其余人(86.86%)認(rèn)為食用貫葉馬兜鈴可能有潛在風(fēng)險(xiǎn)。但鑒于周圍從來沒有腎病的發(fā)生，他們自己也沒有不舒服感，因此認(rèn)為食用貫葉馬兜鈴應(yīng)該毒性比較小，他們會(huì)繼續(xù)食用已經(jīng)使用上百年的該傳統(tǒng)香料，只是他們會(huì)考慮酌情降低使用量和食用頻率。就社區(qū)的訪談來看，當(dāng)?shù)鼐用裢ǔ?huì)將貫葉馬兜鈴的干燥葉5～10片(約0.8～1.5 g干重)揉碎后撒到已經(jīng)煮熟并擺放到餐桌的食物上。或?qū)⒏稍锶~2～3 g放到清湯或火鍋中進(jìn)行煮沸后，食用去除膻味的菜肴和湯。一個(gè)家庭在貫葉馬兜鈴材料能保證的情況下，通常每餐都會(huì)添加一些干燥葉粉末。因此，我們按照少數(shù)民族地區(qū)每家平均5人，每天吃1次，每次1 g，貫葉馬兜鈴秋季成熟，食用時(shí)間為3個(gè)月，每個(gè)成人估計(jì)重約60 kg，馬兜鈴酸含量以5.5 μg/g葉干重來計(jì)算，每年每人每1 kg組織里面馬兜鈴酸I的攝入量約為1.65×10-6g/kg(不考慮代謝，假設(shè)均為積累在體內(nèi))。社區(qū)調(diào)查還發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)鼐用裢ǔ２皇秤秘炄~馬兜鈴的果實(shí)或根，或僅在做火鍋的時(shí)候，偶爾添加根和果實(shí)增加菜肴的視覺效果和風(fēng)味。

3 結(jié)論

貫葉馬兜鈴是滇西北和川西地區(qū)著名的辛香料傳統(tǒng)芳香植物原料，它的干燥葉能有效去除食物中的腥味和膻味，并能增加菜肴的風(fēng)味。因此，30多年前就有研究人員開展過該物種的精油組成研究。上述研究發(fā)現(xiàn)貫葉馬兜鈴的主要精油成分是反式-2-十一碳烯醛，且含量可達(dá)94.2%不等。最近其他研究者進(jìn)一步的分析表明貫葉馬兜鈴的主要精油成分是反式-2-葵烯醛(52.0%)，而不是十一碳的烯醛。然而，和文佳等[13]最近通過研究貫葉馬兜鈴無菌苗和愈傷組織揮發(fā)性成分揭示其主要成分為γ-杜松烯(37.80%和35.78%)、乙酸龍腦酯(17.09%和15.54%)、8-異丙基-2,5-二甲基-5,6,7,8-四氫-1-萘酚(10.30%和19.10%)等。但上述研究均為水蒸氣蒸餾獲得的精油成分，且所得的結(jié)果差別較大。我們推測(cè)這種不一致性可能和不同研究者材料的來源、采集的季節(jié)和環(huán)境生長(zhǎng)及材料存貯的條件或遺傳基礎(chǔ)有關(guān)系，也可能是揮發(fā)性成分鑒定方面不同研究者存在誤判。

本研究沒有采用典型的水蒸氣蒸餾獲得精油的研究方法，而是按照當(dāng)?shù)鼐用竦氖秤昧?xí)慣(直接將干燥葉片搓揉成粉末撒在食物上)，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)動(dòng)態(tài)吸附法收集的貫葉馬兜鈴干燥葉的氣味開展研究，我們認(rèn)為這樣才能代表當(dāng)?shù)鼐用袷秤秘炄~馬兜鈴時(shí)的真正感官體驗(yàn)。研究表明干燥葉中主要的揮發(fā)成分是反式-2-葵烯醛(79.79%)、3-十二烯醛(4.26%)、辛醛(2.49%)等，結(jié)果和Li等的結(jié)論比較接近。此外，我們使用在Sigma購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)主要成分進(jìn)行共注射比對(duì)，并比較標(biāo)準(zhǔn)品和主要成分的質(zhì)譜圖，結(jié)果均證明反式-2-葵烯醛應(yīng)該是貫葉馬兜鈴揮發(fā)物中的典型主要成分。我們研究團(tuán)隊(duì)21人的嗅覺試聞結(jié)果也表明，標(biāo)準(zhǔn)品的氣味和貫葉馬兜鈴干燥葉片搓揉后釋放的氣味難以區(qū)分。因此，雖然蒸餾處理后通常導(dǎo)致植物的組織細(xì)胞及代謝相關(guān)的酶產(chǎn)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致?lián)]發(fā)物可能出現(xiàn)變化。但就本研究而言，蒸餾法和動(dòng)態(tài)頂空吸附法的結(jié)果比較接近，僅存在主要化合物的含量變化。

雖然以前對(duì)貫葉馬兜鈴的葉的揮發(fā)性成分有較多研究，但對(duì)其他部分的揮發(fā)物研究卻沒有開展相應(yīng)的工作。本研究首次報(bào)道了貫葉馬兜鈴干燥根的揮發(fā)性成分組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)和地上部分葉的揮發(fā)物成分差異極大。該植物根中主要成分為乙酸龍腦酯(37.08%)、尼泊金丙酯(22.29%)、1,3,8-p-孟三烯(19.93%)和莰烯(6.39%)，然而這些成分均不在我們分析的干燥葉的揮發(fā)性成分之中(見表1)。我們推測(cè)可能和貫葉馬兜鈴地上和地下部分的分工不同進(jìn)而導(dǎo)致的代謝產(chǎn)物不同有關(guān)。值得注意的是，根中最主要成分乙酸龍腦酯卻在貫葉馬兜鈴無菌苗和愈傷組織揮發(fā)性成分中被報(bào)道。以前的研究發(fā)現(xiàn)乙酸龍腦酯具有鎮(zhèn)痛抗炎[14]的作用，而尼泊金丙酯是新穎的防腐劑[15]，這些主要成分在貫葉馬兜鈴中出現(xiàn)的原因及其日化香精方面的功能值得探索。

馬兜鈴酸的腎毒性早在20多年前就得到比較充分的研究，最近馬兜鈴酸的肝毒性再次激起公眾的廣泛關(guān)注。雖然科研人員、政府工作人員、城市居民可能知道馬兜鈴酸攝入后導(dǎo)致的潛在安全隱患，但偏遠(yuǎn)地區(qū)的社區(qū)居民可能并不知道使用該類植物材料存在的健康風(fēng)險(xiǎn)[16]。我們?cè)诘嵛鞅钡貐^(qū)做社區(qū)調(diào)查工作時(shí)，也常常遇到銷售和食用貫葉馬兜鈴的情況。雖然2010版本的《中國(guó)藥典》中規(guī)定細(xì)辛中馬兜鈴酸I的使用不應(yīng)該超過干物質(zhì)的0.001%。就本研究來看，馬兜鈴酸I的含量在根和果實(shí)中遠(yuǎn)超過國(guó)家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。貫葉馬兜鈴葉中的自然含量不高，但它里面多個(gè)馬兜鈴酸同系物的情況決定該類成分含量應(yīng)該不會(huì)低于10 μg/g干物質(zhì)(陳高等，未發(fā)表數(shù)據(jù))。我們的社區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)約有86.9%的社區(qū)居民還是會(huì)選擇謹(jǐn)慎地食用貫葉馬兜鈴。我們大致的評(píng)估表明一個(gè)60 kg成人每年攝入的馬兜鈴酸I的含量約為100 μg。最近的研究揭示馬兜鈴酸致癌的機(jī)制是它的代謝產(chǎn)物dA-AAI可以跟人體DNA形成加合物，只需要一個(gè)小堿基改變可能就會(huì)導(dǎo)致癌變的風(fēng)險(xiǎn)[17]。因此，對(duì)于馬兜鈴酸而言，可能沒有安全劑量一說，攝入越多，危害越大。貫葉馬兜鈴根和果實(shí)中的馬兜鈴酸I和II的含量極高，我們建議當(dāng)?shù)鼐用癫灰谥蠡疱伒臅r(shí)候加入果實(shí)或根作為食材。雖然貫葉馬兜鈴葉中的馬兜鈴酸看起來不高，僅為干物質(zhì)的0.00055%。但鑒于馬兜鈴酸及其衍生物的致突變性，我們建議社區(qū)居民也不要將貫葉馬兜鈴的葉作為食材。

以前的研究發(fā)現(xiàn)馬兜鈴科馬兜鈴屬植物葉片通常釋放多樣化的氣味，不同的種類之間差異極大[18]?？紤]到很多鳳蝶科的蝴蝶幼蟲均以馬兜鈴科植物為特異寄主[19]，我們推測(cè)不同種類釋放的獨(dú)特氣味可能是鳳蝶類長(zhǎng)距離定位寄主的嗅覺信號(hào)物質(zhì)。此外，貫葉馬兜鈴的氣味類似蝽類的化學(xué)防御物質(zhì)，該植物在金沙江干熱河谷進(jìn)化出來的氣味是否能驅(qū)避草食動(dòng)物的過度取食，也是值得進(jìn)一步研究的生態(tài)適應(yīng)性問題。最后，貫葉馬兜鈴由于分布范圍狹窄，長(zhǎng)期受到挖掘，目前該物種的野外居群已經(jīng)難覓蹤跡。不知道當(dāng)?shù)鼐用窠档褪秤秘炄~馬兜鈴是否能為該物種的生存帶來生機(jī)？我們希望本研究能在一定程度上為保護(hù)貫葉馬兜鈴及以其葉為生的達(dá)摩麝鳳蝶受威脅的生態(tài)關(guān)系提供借鑒意義。