天然復合香辛料對低鹽四川泡菜內(nèi)微生物菌系的影響研究

張婷，李曉，許航，唐啟賢，賈利蓉,2，段飛霞,2*

(1.四川大學 輕紡與食品學院，成都 610065；2.四川大學食品科學與技術四川省高校重點實驗室，成都 610065)

四川低鹽泡菜是以新鮮蔬菜為主要原料，添加(或不添加)香辛料等輔料，用食鹽或食鹽水泡漬發(fā)酵，經(jīng)拌料(調(diào)味)、包裝(或不包裝)、滅菌(或不滅菌)等加工而成的蔬菜制品[1]。泡菜中的活性乳酸菌能夠保護胃腸道、增強免疫力[2]，而傳統(tǒng)高鹽腌漬生產(chǎn)工藝會對人體健康和環(huán)境產(chǎn)生不利影響，因此低鹽活性益生菌型健康泡菜成為行業(yè)發(fā)展趨勢。但低鹽腌漬不足以抑制有害微生物的生長，從而導致泡菜風味劣變，亞硝酸鹽積累，嚴重時造成泡菜腐敗。

天然香辛料是四川泡菜加工過程中的常用輔料，具有抑菌、抗氧化、增香等作用[3-7]?，F(xiàn)有研究主要在于香辛料的抑菌作用和機制，對香辛料在低鹽泡菜發(fā)酵過程中的選擇性抑菌作用及其對亞硝酸鹽的影響研究較少。本文以辣椒、花椒、大蒜和生姜為研究對象，考察了復合香辛料對低鹽泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌、酵母菌、芽孢菌生長和亞硝酸鹽積累的影響，并通過正交實驗得出最優(yōu)配比，對低鹽活性益生菌型健康低鹽泡菜的生產(chǎn)有一定指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白蘿卜、辣椒、花椒、大蒜、生姜：當?shù)?成都)農(nóng)業(yè)公司；食鹽：四川久大制鹽有限公司；孟加拉紅培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：北京奧博星有限公司；MRS培養(yǎng)基：杭州微生物試劑有限公司；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰乙酸、硼酸鈉、鹽酸、氨水、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺：成都科隆化學品有限公司；腸膜明串珠菌、植物乳桿菌：四川高福記生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

101型電熱恒溫鼓風干燥箱、PYX-DHS-X型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱、GRP-9160型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；2XZ-2直聯(lián)旋片式真空泵 上海滬析實業(yè)有限公司；LDZX-50FB型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1C型醫(yī)用超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司；pHS-3C型pH計 杭州奧立龍儀器有限公司；UV-1800紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；KSK型恒溫水浴鍋 上?？莆鲈囼瀮x器廠；BSA224S型分析天平 上海新航儀器廠；Eppendorf移液器 德國普蘭德公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 低鹽泡菜的制作工藝

低鹽泡菜的制作工藝流程圖見圖1。

圖1 低鹽泡菜的制作工藝流程圖

1.3.1.1 原料預處理

白蘿卜洗凈、瀝干后切分為2 cm×2 cm×2 cm的小塊；大蒜去皮、清洗、瀝干、切片后備用；辣椒、生姜清洗、瀝干、切片后備用；花椒清洗、瀝干后備用。

1.3.1.2 接種與發(fā)酵

采用預滅菌的鹽水與蒸餾水進行低鹽泡菜腌漬。鹽水和蘿卜以2∶1的比例放入廣口瓶中，食鹽終濃度4%，乳酸菌接種濃度5×103cfu/mL，0.1 mm聚乙烯薄膜封口模擬低鹽泡菜實際生產(chǎn)過程中的發(fā)酵環(huán)境，22 ℃恒溫發(fā)酵。

1.3.2 檢測方法

1.3.2.1 pH的測定

按照GB 5009.237-2016，用pH計測定低鹽泡菜的pH值。

1.3.2.2 亞硝酸鹽的測定

按照GB 5009.33-2016，用鹽酸萘乙二胺法測定亞硝酸鹽的含量。

1.3.2.3 菌落計數(shù)

取1 mL發(fā)酵液，以1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000，1∶100000梯度稀釋后制備稀釋液。按照GB 4789.35-2016，用0.1 mL稀釋液接入凝固后的MRS瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃厭氧恒溫培養(yǎng)48 h后計數(shù)為乳酸菌活菌總數(shù)；按照GB 4789.15-2010，用0.1 mL稀釋液接入孟加拉紅培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)5天后計數(shù)為酵母菌總數(shù)；按照GB 4789.2-2010，用0.1 mL稀釋液于80 ℃加熱10 min后接入瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后計數(shù)為芽孢菌總數(shù)；按照GB 4789.2-2010，用0.1 mL稀釋液接入瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后計數(shù)為菌落總數(shù)。

1.3.2.4 感官評價方法

采取計分法對各樣品的色澤、質(zhì)地、風味進行感官評定，外觀、質(zhì)地、風味的權重分別為0.3，0.2，0.5[8]。外觀評價標準：呈現(xiàn)出蘿卜應有的色澤，湯汁清亮，無浮膜[9]，總分100分；質(zhì)地評價標準：蘿卜有彈性，咀嚼時口感脆嫩，總分100分；風味評價標準：酸爽可口，香味濃郁，總分100分。綜合評分高于80分，則認為樣品對整體感官品質(zhì)的影響在可接受范圍內(nèi)，其濃度范圍可用于后續(xù)正交實驗。

1.3.3 單因素實驗及正交實驗

按照圖1所示工藝，在低鹽泡菜發(fā)酵至pH 3.5后加入天然香辛料，24 h后檢測低鹽泡菜中乳酸菌、芽孢菌、酵母菌的菌落總數(shù)，并與未加天然香辛料的低鹽泡菜做對比。再依據(jù)單個香辛料單獨作用的實驗結果，采取 L9(34)的正交實驗方案研究香辛料影響四川低鹽泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌和其他微生物生長的協(xié)同作用，在此基礎上形成香辛料復配的最佳條件，并評價該條件下低鹽泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌、酵母菌、芽孢菌的消長情況、pH變化趨勢和亞硝酸鹽積累以及低鹽泡菜樣品的感官品質(zhì)。

2 結果與分析

2.1 單一香辛料對低鹽泡菜中微生物生長和感官品質(zhì)的影響

2.1.1 辣椒對低鹽泡菜中微生物生長和感官品質(zhì)的影響

表1 辣椒對低鹽泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌、酵母菌、芽孢菌和感官品質(zhì)的影響

由表1可知，辣椒抑菌效果顯著，辣椒添加量為1.2 g/dL時，對芽孢菌的抑制率大于90%，對酵母菌的抑菌率為85%；當辣椒添加量為2.4 g/dL時，對芽孢菌和酵母菌的抑菌率均大于90%；當辣椒添加量超過4.8 g/dL時，辣味過重，導致低鹽泡菜香氣被掩蔽，色澤變暗，整體感官評分低于80分。結合感官評價和抑菌實驗結果，辣椒添加量在 2.4～4.8 g/dL時，具有較好的抑菌作用，且對低鹽泡菜感官品質(zhì)無明顯不良影響。

2.1.2 大蒜對低鹽泡菜中微生物生長和感官品質(zhì)的影響

表2 大蒜對低鹽泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌、酵母菌、芽孢菌和感官品質(zhì)的影響

由表2可知，低鹽泡菜中，大蒜添加量達到6.0 g/dL時，對酵母菌和芽孢菌生長的抑制率均在90%以上。當大蒜添加量達到12.0 g/dL時，整體呈現(xiàn)出濃郁的腌漬大蒜風味，感官綜合評分低于80分。因此，結合感官評價和抑菌實驗結果，認為大蒜的適宜添加范圍為 6.0～10.0 g/dL。

2.1.3 花椒對低鹽泡菜中微生物生長和感官品質(zhì)的影響

表3 花椒對低鹽泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌、酵母菌、芽孢菌和感官品質(zhì)的影響

由表3可知，花椒對芽孢菌和酵母菌均有抑制作用，且對芽孢菌的抑制效果優(yōu)于酵母菌?；ń诽砑恿窟_到1.8 g/dL時，對芽孢菌的抑制率達95%，對酵母菌的抑制率僅為64.9%；當花椒用量增加到3.0 g/dL時，對酵母菌的抑制率僅為66.3%?；ń穼Φ望}泡菜的風味和色澤有較大的影響。當花椒添加量為2.4 g/dL時，低鹽泡菜產(chǎn)生令人不適的麻味，發(fā)酵液和蘿卜塊的色澤變?yōu)楹稚?，感官評分低于80分。結合感官評價和抑菌實驗結果，認為花椒單獨作用時應該選擇添加量為0.6～1.8 g/dL。

2.1.4 生姜對低鹽泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌、酵母菌、芽孢菌菌落數(shù)和感官品質(zhì)的影響

表4 生姜對低鹽泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌、酵母菌、芽孢菌和感官品質(zhì)的影響

由表4可知，生姜對低鹽泡菜中酵母菌、芽孢菌生長的抑制能力較弱。生姜添加量為12.0 g/dL時，對芽孢菌的抑制率僅為52%，而此濃度下低鹽泡菜已呈現(xiàn)出明顯的澀味，感官綜合評分低于80分。因此，結合抑菌實驗和感官評價結果，生姜的適宜添加量為6.0～10.0 g/dL。

綜上所述，4種香辛料，辣椒、大蒜、花椒、生姜對四川低鹽泡菜發(fā)酵過程中酵母菌、芽孢菌的生長均具有不同程度的抑制作用，其對芽孢菌的抑菌能力大小為：辣椒>大蒜>花椒>生姜；對酵母菌的抑菌能力大小為：辣椒>大蒜>生姜>花椒。4種香辛料單獨作用時，對乳酸菌的生長均沒有明顯的抑制作用，辣椒對乳酸菌的生長有微弱的促進作用。

添加量較高時，4種香辛料對低鹽泡菜的感官品質(zhì)均有不同程度的影響，主要表現(xiàn)在：其特征性風味過于突出，掩蔽低鹽泡菜原有的香氣和滋味，并對低鹽泡菜的色澤產(chǎn)生不利影響。因此，香辛料對低鹽泡菜感官品質(zhì)的影響限制了其單獨使用時的濃度范圍，因此單一香辛料單獨作用難以抑制低鹽泡菜中有害菌的生長。為同時實現(xiàn)對低鹽泡菜中有害菌的抑制和感官品質(zhì)的提升，有必要對以上香辛料進行復配。

選擇低鹽泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌、酵母菌、芽孢菌的生長狀況作為測定指標，采用正交實驗對4種香辛料：辣椒(2.4～4.8 g/dL)、大蒜(6.0～10.0 g/dL)、花椒(0.6～1.8 g/dL)、生姜(6.0～10.0 g/dL)的復配方案進行優(yōu)化。

2.2 復合香辛料對低鹽泡菜中微生物生長和感官品質(zhì)的影響

正交實驗中，不同配比的復合香辛料對低鹽泡菜中微生物生長和感官品質(zhì)的影響見表5。

表5 復合香辛料對低鹽泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌、酵母菌、芽孢菌和感官品質(zhì)的影響

由極差分析可知，對低鹽泡菜中酵母菌生長影響最大的因素為辣椒添加量，酵母菌抑制率隨辣椒添加量上升而增大；對芽孢菌生長影響最大的因素為花椒添加量，其后依次為辣椒、生姜和大蒜。當復配比例為辣椒3.6 g/dL、大蒜8 g/dL、花椒1.8 g/dL、生姜6 g/dL時，復合香辛料對低鹽泡菜中芽孢菌和酵母菌的抑菌率均達98%以上，低鹽泡菜乳酸菌數(shù)為2.0×108cfu/mL，感官綜合評分為90分，低鹽泡菜液澄清，香氣濃郁，口感脆嫩，該復配比例為最佳配比。

2.3 最優(yōu)配比下的復合香辛料對低鹽泡菜中乳酸菌、pH和亞硝酸鹽積累的影響

按正交實驗最佳配比將4種香辛料復配后，添加到低鹽泡菜中，考察低鹽泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌數(shù)量、pH值和亞硝酸鹽的積累情況，實驗結果見圖2。

圖2 復合香辛料對低鹽泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌、pH值和亞硝酸鹽積累的影響

由圖2可知，對照組中乳酸菌在發(fā)酵第1天為7.12 log cfu/mL，乳酸菌數(shù)隨發(fā)酵時間延長而增加，第4天達到峰值7.65 log cfu/mL后有緩慢下降，第7天乳酸菌活菌數(shù)為7.01 log cfu/mL。對照組pH值隨發(fā)酵時間降低，第1天為5.1，第4天后降低到3.5以下，第7天達到3.0。對照組中亞硝酸鹽的含量隨發(fā)酵時間延長不斷增加，第1天為14.51 mg/kg，第4天已達到20.22 mg/kg(高于GB 2762-2017對亞硝酸鹽的限量要求)。

復合香辛料組的乳酸菌生長情況及pH變化情況，與對照組相比無顯著差異。復合香辛料組的亞硝酸鹽含量變化呈先增加后減少的趨勢，在發(fā)酵第2天為3.51 mg/kg，第3天達到峰值17.49 mg/kg后快速下降，到發(fā)酵第5天降至檢測限以下。

泡菜中亞硝酸鹽的積累主要與泡菜原料的種類、泡菜液的氧濃度、pH、乳酸菌活菌數(shù)和產(chǎn)硝酸鹽還原酶的雜菌數(shù)量有關。低鹽泡菜對照組中，由于缺乏高濃度食鹽對微生物生長的抑制作用，酵母菌、芽孢菌等具有硝酸鹽還原酶的微生物與乳酸菌共同生長，導致亞硝酸鹽快速積累。而添加復合香辛料的低鹽泡菜，在發(fā)酵前期，由于乳酸菌生長緩慢，pH較高，使得酵母菌、芽孢菌等雜菌的生長繁殖盡管受到復合香辛料的抑制，但數(shù)量仍然較高，導致亞硝酸鹽積累，達到峰值。在第3天以后，泡菜液環(huán)境中氧氣消耗殆盡，乳酸菌數(shù)量增加，pH下降，含硝酸鹽還原酶的雜菌生長被復合香辛料顯著抑制，既有的亞硝酸鹽在高酸性條件下被化學降解或被乳酸菌還原降解[10-16]，使得其含量下降，直至為0。

3 結論

通過本文的研究發(fā)現(xiàn)，低鹽泡菜在發(fā)酵過程中，失去高濃度食鹽形成的高滲透壓的抑菌環(huán)境，在發(fā)酵初期易出現(xiàn)酵母菌、芽孢菌等有害雜菌的快速生長，不僅導致泡菜品質(zhì)劣變，同時造成亞硝酸鹽的大量積累，食用后不利于人體健康。通過單因素和正交實驗，優(yōu)化得到復合天然香辛料抑制低鹽泡菜中有害雜菌生長的最優(yōu)配比(辣椒3.6 g/dL、大蒜8 g/dL、花椒1.8 g/dL、生姜6 g/dL)，在顯著抑制低鹽泡菜發(fā)酵過程中酵母菌、芽孢菌生長的基礎上，不降低低鹽泡菜中活性乳酸菌數(shù)量，且能有效降低成熟低鹽泡菜中亞硝酸鹽的含量，有望成為低鹽四川泡菜生產(chǎn)和制作過程中控制微生物污染和防止亞硝酸鹽積累的有效措施。