響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取龍眼葉總黃酮的工藝研究

鄭威，于雪飛，王亞立，李春研，李家磊

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱 150076；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)圖書(shū)館，哈爾濱 150028；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品加工研究所，哈爾濱 150086)

龍眼葉為無(wú)患子科龍眼屬常綠喬木龍眼(DimocarpuslonganLour.)的嫩芽或葉子，為我國(guó)廣西地區(qū)傳統(tǒng)的藥食同源植物，人們常以茶的形式飲用[1]。我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，龍眼葉性味甘平，具有清熱解表、祛濕排毒等作用[2]?，F(xiàn)代西方醫(yī)學(xué)認(rèn)為，龍眼葉具有降血糖、抗氧化、抗病毒以及抗腫瘤等功效[3-6]。龍眼葉表現(xiàn)出的諸多藥理活性得益于其含有豐富的活性成分，研究表明，龍眼葉主要含有黃酮類、甾醇類和萜類等活性物質(zhì)，其中尤以黃酮類化合物較為豐富[7]。黃酮類物質(zhì)作為植物的次生代謝產(chǎn)物，具有很高的藥用價(jià)值，對(duì)預(yù)防癌癥、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂、治療冠心病、高血壓、支氣管哮喘以及心絞痛等有顯著效果[8，9]。

目前，人們對(duì)龍眼葉的開(kāi)發(fā)利用尚不充分，這就造成了資源的浪費(fèi)。由于龍眼葉含有豐富的黃酮類物質(zhì)，因此其可作為提取黃酮類化合物的原料來(lái)源。提取黃酮類化合物的方法有很多，主要有溶劑浸提法、勻漿提取法、酶輔助提取法、微波輔助提取法以及超聲輔助提取法[10-14]。由于超聲輔助提取法具有溶劑用量少、提取時(shí)間短以及提取率高等特點(diǎn)，因此越來(lái)越多的提取工藝采用超聲輔助提取法[15]。鑒于此，本文以龍眼葉為原料，以乙醇溶液為溶劑，在單因素的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)超聲輔助提取龍眼葉總黃酮的工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在探索出一種高效的龍眼葉總黃酮的提取工藝，進(jìn)而為后期綜合利用龍眼葉提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍眼葉：福建省梅州龍眼葉種植基地；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)：成都思特曼生物有限公司；無(wú)水乙醇：北京化工有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-400KDE型高功率超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；CARY100型紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Varian公司；XS204型分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；DK-98-II A型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHB-III型循環(huán)水式真空泵 鞏義市英峪高科儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 龍眼葉總黃酮的提取

將新鮮龍眼葉50 ℃烘干，粉碎過(guò)60目篩，然后稱取1 g龍眼葉粉置于燒杯中，在一定的提取溫度、液料比、乙醇濃度和提取時(shí)間的條件下進(jìn)行總黃酮的超聲提取，然后將得到的提取液抽濾、定容待測(cè)。

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品18.9 mg，用95%的乙醇溶解后定容至100 mL的容量瓶中待用；稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL后置于25 mL容量瓶中，加入1 mL 1%氯化鋁溶液，用95%的乙醇溶液定容、搖勻，靜置20 min；在410 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值；吸光值測(cè)定重復(fù)3次，并取平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=13.566X-0.0258，R2=0.9966。

1.3.3 龍眼葉總黃酮得率的計(jì)算

將龍眼葉提取液按1.3.2操作，測(cè)得吸光度，由蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得總黃酮質(zhì)量，龍眼葉總黃酮得率按下式計(jì)算。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

考察單因素乙醇濃度(10%，30%，50%，70%，90%)，液料比(10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1)，超聲時(shí)間(60，90，120，150，180 min)和超聲溫度(40，50，60，70，80 ℃)對(duì)龍眼葉總黃酮得率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以超聲時(shí)間、超聲溫度、液料比和乙醇濃度為考察因素，以龍眼葉總黃酮得率為響應(yīng)值，選用響應(yīng)面Box-Benhnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)超聲輔助提取龍眼葉總黃酮的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)都進(jìn)行 3 次重復(fù)，所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，采用 Origin 8.5 軟件作圖；響應(yīng)面Box-Benhnken 試驗(yàn)采用 Design-Expert V8.0.6.1 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)龍眼葉總黃酮得率的影響

2.1.1 乙醇濃度對(duì)龍眼葉總黃酮得率的影響

選擇超聲時(shí)間為120 min，超聲溫度為60 ℃，液料比為30∶1，分別用10%，30%，50%，70%，90%的乙醇溶液進(jìn)行龍眼葉總黃酮的提取，得率見(jiàn)圖1。

圖1 乙醇濃度對(duì)龍眼葉總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids from longan leaves

總黃酮的得率隨乙醇濃度的增大先升高后降低。當(dāng)乙醇的體積濃度達(dá)到70%時(shí)，總黃酮的得率最大，隨著乙醇濃度的繼續(xù)升高，總黃酮的得率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。產(chǎn)生的原因可能是當(dāng)乙醇濃度過(guò)大時(shí)，易溶于乙醇溶液的雜質(zhì)與龍眼葉總黃酮競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合乙醇-水分子加劇，加之整個(gè)溶液體系粘度增大，導(dǎo)致龍眼葉總黃酮溶出困難，因此，70%的乙醇分?jǐn)?shù)適用于龍眼葉總黃酮的提取溶劑。

2.1.2 液料比對(duì)龍眼葉總黃酮得率的影響

選擇超聲時(shí)間為120 min，超聲溫度為60 ℃，乙醇濃度為50%，分別用10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1的液料比提取龍眼葉總黃酮，得率見(jiàn)圖2。

圖2 液料比對(duì)龍眼葉總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of total flavonoids from longan leaves

隨著液料比的增加，總黃酮的得率呈先增加后下降的趨勢(shì)，當(dāng)液料比為40∶1時(shí)，總黃酮的得率達(dá)到最大值。當(dāng)液料比繼續(xù)增加，總黃酮的得率隨之降低，這可能與溶劑的使用量相關(guān)，溶劑量增大，樣品的分散程度好，接觸面積變大，利于黃酮物質(zhì)的溶出，增加得率；溶劑的使用量過(guò)大時(shí)，一些可能與黃酮結(jié)合的雜質(zhì)溶出，導(dǎo)致總黃酮得率的降低。因此，本試驗(yàn)的最佳提取液料比為40∶1。

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)龍眼葉總黃酮得率的影響

選擇乙醇濃度為50%，液料比為30∶1，超聲溫度為60 ℃，分別用60，90，120，150，180 min提取龍眼葉總黃酮，得率見(jiàn)圖3。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)龍眼葉總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the yield of total flavonoids from longan leaves

當(dāng)超聲時(shí)間為120 min時(shí)，龍眼葉總黃酮的得率達(dá)到最大值，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮的得率逐漸降低，這可能是由于龍眼葉總黃酮在120 min內(nèi)已經(jīng)全部提取完成，若提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，黃酮易被氧化和降解，導(dǎo)致得率的降低。因此，本試驗(yàn)的最佳提取時(shí)間為120 min。

2.1.4 超聲溫度對(duì)龍眼葉總黃酮得率的影響

選擇乙醇濃度為50%，液料比為30∶1，超聲時(shí)間為120 min，分別用40，50，60，70，80 ℃提取龍眼葉總黃酮，得率見(jiàn)圖4。

圖4 超聲溫度對(duì)龍眼葉總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the yield of total flavonoids from longan leaves

龍眼葉總黃酮的得率隨溫度的增加先升高后降低，當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，總黃酮的得率達(dá)到最大值。隨著溫度繼續(xù)升高，總黃酮的得率逐漸降低，這可能是由于適當(dāng)?shù)厣邷囟瓤捎行У亟档腿芤后w系的粘度，有利于黃酮類物質(zhì)的擴(kuò)散和溶解度的增加，然而溫度過(guò)高導(dǎo)致黃酮氧化和降解，從而使得龍眼葉總黃酮的得率下降。因此，本試驗(yàn)的最佳提取溫度為60 ℃。

2.2 響應(yīng)面法確定龍眼葉總黃酮得率的最佳工藝參數(shù)

2.2.1 響應(yīng)模型的建立與分析

本文在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，用自變量A，B，C，D分別代表乙醇濃度、液料比、超聲溫度、超聲時(shí)間4個(gè)影響因素，以龍眼葉總黃酮得率為響應(yīng)值Y。本文設(shè)計(jì)的試驗(yàn)因素水平及編碼值見(jiàn)表1，響應(yīng)面分析方案與結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface

表2 響應(yīng)面分析方案與結(jié)果Table 2 Analysis and results of response surface

續(xù) 表

利用Design-Expert V8.0.6.1軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸模型方程擬合，獲得的回歸模型方程如下：

Y=162.23+15.49A+8.09B+8.95C+22.24D-4.18AB-4.59AC-4.79AD-0.76BC-3.52BD-4.89CD-5.56A2-1.63B2-8.13C2-18.02D2。

式中：Y為總黃酮得率，mg/g；A為乙醇濃度，%；B為液料比；C為超聲溫度，℃；D為超聲時(shí)間，min。

回歸方程的方差分析結(jié)果見(jiàn)表3，模型的P值<0.0001，差異極顯著；失擬項(xiàng)P=0.2968>0.05，差異不顯著；模型確定系數(shù) R2=0.9599；模型調(diào)整確定系數(shù)Radj2=0.9198；方差分析結(jié)果表明模型的擬合度良好，試驗(yàn)的誤差小，所建模型能夠很好地反映響應(yīng)值的變化。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression model analysis of variance

續(xù) 表

注：“*”表示顯著差異，P<0.05；“**”表示極顯著差異，P<0.01；R2=0.9599；Radj2=0.9198。

P值可檢查各個(gè)因素的顯著性，由P值結(jié)果可知，因素 A，B，C，D，C2和D2極顯著，A2顯著，其他因素不顯著，影響程度主次順序?yàn)镈>A>D2>C>B>A2。

響應(yīng)面圖是響應(yīng)值對(duì)各試驗(yàn)因素所構(gòu)成的三維空間曲面圖，可直觀反映各試驗(yàn)因素的交互作用及對(duì)響應(yīng)值的相對(duì)顯著性。任意2個(gè)試驗(yàn)因素交互作用的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖5。

圖5 任意2個(gè)因素交互作用對(duì)龍眼葉總黃酮得率影響的響應(yīng)面圖

由圖5可知，任意2個(gè)試驗(yàn)因素之間均存在明顯的交互作用，并且最佳落點(diǎn)在試驗(yàn)考察的區(qū)域內(nèi)。

2.2.2 最佳提取條件的確定及驗(yàn)證

通過(guò)對(duì)工藝參數(shù)的優(yōu)化，本文建立了以龍眼葉總黃酮提取率為目標(biāo)值的試驗(yàn)體系。最佳工藝條件為：乙醇提取濃度90%，液料比48∶1，提取溫度61 ℃，提取時(shí)間132 min。在最優(yōu)的條件下對(duì)建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。獲得的龍眼葉總黃酮的實(shí)際測(cè)得值為181.83 mg/g，預(yù)測(cè)值為177.32 mg/g，預(yù)測(cè)誤差為2.54%，小于5%，因此，證實(shí)了預(yù)測(cè)值的準(zhǔn)確可靠。

表4 最優(yōu)條件的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值(n=3)Table 4 The predicted value and measured value of the optimal conditions(n=3)

3 結(jié)論

本文以龍眼葉為原料，以乙醇溶液為溶劑，在單因素的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)超聲輔助提取龍眼葉總黃酮的工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳工藝條件為：乙醇濃度90%，液料比48∶1，提取溫度61 ℃，提取時(shí)間132 min。龍眼葉總黃酮得率的預(yù)測(cè)值為177.32 mg/g，實(shí)際值為181.83 mg/g，與優(yōu)化方案的理論值相接近，表明建立的模型可靠。因此，本文所采用的響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取龍眼葉總黃酮的工藝穩(wěn)定可靠，該工藝可為龍眼葉的綜合利用及龍眼葉總黃酮的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供一定的理論支撐。