香菜中多酚的提取工藝及抑菌性研究

宋 力，趙祥華

(信陽(yáng)師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院 , 河南 信陽(yáng) 464000)

0 引言

香菜異名胡荽、芫荽、松須菜，在我國(guó)南北各地均有栽培,是藥用和調(diào)味常用的一種芳香蔬菜，香菜中富含鈣、鐵、胡蘿卜素等多種營(yíng)養(yǎng)成分和有效的多酚類(lèi)抗氧化劑.多酚類(lèi)物質(zhì)具有清除機(jī)體內(nèi)自由基、延緩機(jī)體衰老、預(yù)防心血管疾病、防癌、抗輻射、抗過(guò)敏、抗菌消炎等功能，抗氧化劑的研究和應(yīng)用越來(lái)越受到重視[1-3].

已采用熱回流提取法、超聲波提取法、反相高效液相色譜法對(duì)香菜中綠原酸、總黃酮、蘆丁的提取進(jìn)行了探討[4-6].本實(shí)驗(yàn)采用微波輔助提取法，研究探討提取劑濃度、料液比、微波功率、提取時(shí)間等實(shí)驗(yàn)因素對(duì)香菜中多酚類(lèi)物質(zhì)提取率的影響.通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝條件，選用沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)樣品，測(cè)定香菜中多酚的含量，并進(jìn)行抑菌性測(cè)定.

微波輔助提取法所需的設(shè)備廉價(jià)、操作簡(jiǎn)單、提取率高、所需提取時(shí)間短，大大減少了多酚類(lèi)物質(zhì)在高溫下的被氧化，從而提高了產(chǎn)品的品質(zhì)和收率.香菜中多酚對(duì)大腸桿菌有明顯抑制作用，此工作可進(jìn)一步對(duì)香菜的開(kāi)發(fā)利用提供有價(jià)值的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮香菜(市售).

無(wú)水乙醇、95%乙醇、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；酒石酸氫鉀，中國(guó)湘中地質(zhì)實(shí)驗(yàn)研究所；沒(méi)食子酸，成都市科龍化工試劑廠；磷酸二氫鈉，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.以上試劑均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

分光光度計(jì)，UV-754型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；快速研磨機(jī)(KM)；湘潭湘儀儀器有限公司；明秀光波，GB023CT-K3，佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司；電動(dòng)振篩機(jī)(8411)，湘潭湘儀儀器有限公司.

1.3 樣品的制備

將新鮮香菜洗凈自然晾干，在70 ℃的干燥箱中干燥9 h，粉碎過(guò)40目篩，避光密封保存.

1.4 微波法測(cè)定香菜中多酚的工藝

準(zhǔn)確稱取2.0000 g香菜粉末，按一定的固液比加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，在微波爐中以一定的微波功率提取，抽濾.準(zhǔn)確移取一定體積的濾液，加入酒石酸亞鐵溶液和磷酸鹽緩沖溶液，充分混勻，靜置15 min.以蒸餾水代替樣品提取液，加入與樣品測(cè)定相同的試劑作為空白對(duì)照.用0.5 cm比色皿，在540 nm波長(zhǎng)處，測(cè)定吸光度A.平行測(cè)定6次，取平均值.

1.5 香菜提取液中多酚含量的測(cè)定

酒石酸亞鐵與香菜提取液中的多酚反應(yīng)生成穩(wěn)定的藍(lán)紫色配合物，配合物的吸光度在一定的濃度范圍內(nèi)與多酚類(lèi)物質(zhì)的濃度成正比.即吸光度越大，表示該條件下香菜提取物中的多酚含量越多[7].

準(zhǔn)確稱取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，充分溶解定容.用移液管分別移取沒(méi)食子酸溶液0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL于50 mL容量瓶中，加入酒石酸亞鐵溶液和的磷酸鹽緩沖溶液，定容，靜置15 min，以不加沒(méi)食子酸溶液的溶液作為空白對(duì)照，用0.5 cm比色皿，在540 nm波長(zhǎng)處用分光光度計(jì)分別測(cè)定吸光度A值.

以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，結(jié)果表明：沒(méi)食子酸濃度在10～80 mg/L內(nèi)與其吸光度呈線性關(guān)系，在此范圍內(nèi)線性回歸方程為y=0.012 93x-0.050 95,R2=0.9995，說(shuō)明沒(méi)食子酸在濃度10～80 mg/L內(nèi)線性關(guān)系良好.

1.6 菌懸液的制備

以大腸桿菌(Escherichiacoli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)為抑菌實(shí)驗(yàn)菌株.

從經(jīng)過(guò)活化2次的菌體斜面上挑取一環(huán)菌體接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使用平板計(jì)數(shù)法調(diào)整濃度為 108cfu/mL.

1.7 抑菌圈測(cè)定[8]

采用濾紙片法測(cè)定提取液對(duì)2種供試菌的抑菌活性.制備直徑為10 mm的圓濾紙片，滅菌，備用.在超凈工作臺(tái)上，向滅菌后的培養(yǎng)皿中倒入培養(yǎng)基，冷卻.取各種待測(cè)菌懸液500 μL，分別均勻涂布在相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上，制成含菌平板. 取濾紙片貼在含菌平板上，每皿3 片，每片濾紙上滴加 10 μL 提取液溶液，以滅菌的蒸餾水作為對(duì)照，于恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)24 h.重復(fù) 5 次，24 h后測(cè)量抑菌直徑，取5次平均值.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

對(duì)影響香菜中多酚類(lèi)物質(zhì)提取率的乙醇濃度、料液比、微波功率、提取時(shí)間分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn).

2.1.1 乙醇濃度的影響

準(zhǔn)確稱取香菜粉末2.0000 g，按料液比1∶30分別加入體積分?jǐn)?shù)為70%、75%、80%、85%的乙醇溶液，在微波功率為60 W的條件下提取50 s，按1.4的方法測(cè)定吸光度，結(jié)果如圖1所示.

由圖1可以看出，當(dāng)乙醇濃度較低時(shí)，提取物的量較少，隨著乙醇濃度的增大，溶液的吸光度隨之增大后又減小，說(shuō)明多酚的提取率隨乙醇濃度的增加先增加后減小.根據(jù)相似相溶原理，隨著溶劑量的增多，多酚的極性增強(qiáng)，會(huì)形成過(guò)飽和溶液反而使多酚得不到充分溶解，提取量逐漸減少[9].當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%，測(cè)得的吸光度最大，香菜中多酚的提取率最高.因此，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%左右為宜.

2.1.2 料液比的影響

準(zhǔn)確稱取香菜粉末2.0000 g，按料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50加入體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液，在微波功率為60 W的條件下提取50 s，按1.4的方法測(cè)定吸光度，結(jié)果如圖2.

由圖2可以看出，多酚的提取率隨固液比的增大先增加后減小，在1∶30達(dá)到最大值.這是由于開(kāi)始時(shí)溶劑用量少,提取不太完全,但當(dāng)溶劑用量逐漸增大,微波加熱的負(fù)荷增大,提取完全所需要的時(shí)間隨之變長(zhǎng),使得提取溶液中多酚濃度降低.因此，選取料液比為1∶30左右為宜.

圖2 料液比對(duì)提取率的影響Fig. 2 Effect of solid/liquid ratio on extraction ratio

2.1.3 微波功率的影響

準(zhǔn)確稱取香菜粉末2.0000 g，按料液比1∶30加入體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液，在微波功率分別為20、40、60、80、100 W的條件下提取50 s，按1.4的方法測(cè)定吸光度，結(jié)果如圖3.

圖3 微波功率對(duì)提取率的影響Fig. 3 Effect of microwave power on extraction ratio

由圖3可以看出，多酚的提取率隨微波功率的增大先增加后減小，在60 W達(dá)到最大值.在一定時(shí)間內(nèi),微波輻射功率越高,體系升溫越快,固液擴(kuò)散速度越快,使細(xì)胞破裂加劇,有利于香菜中有效成分的浸出.但是,當(dāng)微波功率增大到一定程度時(shí)，會(huì)造成局部溫度過(guò)高,導(dǎo)致多酚發(fā)生分解.因此，選取微波功率為60 W左右為宜.

2.1.4 提取時(shí)間的影響

準(zhǔn)確稱取香菜粉末2.0000 g，按料液比1∶30加入體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液，在微波功率為60 W，提取時(shí)間分別為20、30、40、50、60 s條件下提取，按1.4的方法測(cè)定吸光度，結(jié)果如圖4.

由圖4可以看出，多酚的提取率隨提取時(shí)間的增大先升高后降低，在30 s達(dá)到最大值.這可能是由于多酚類(lèi)物質(zhì)的溶解浸出需要時(shí)間，但達(dá)到一定時(shí)間后，有效成分不容易再溶出，隨著提取時(shí)間的加長(zhǎng)，溶劑也發(fā)生揮發(fā)從而影響提取率.因此，選取提取時(shí)間為30 s左右為宜.

圖4 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig. 4 Effect of extraction time on extraction ratio

2.2 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

考慮到不同影響因素間可能相互作用，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定乙醇濃度、微波功率、提取時(shí)間、料液比的實(shí)驗(yàn)條件范圍，選擇L9(34)正交表設(shè)計(jì)四因素三水平實(shí)驗(yàn)，確定香菜中多酚類(lèi)物質(zhì)提取的最佳工藝條件.因素與水平設(shè)置見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2.

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Tab. 1 Factors and levels orthogonal experiment

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果和分析Tab. 2 The results of orthogonal experiment

由表2極差R值得知，各因素對(duì)香菜中多酚提取率的影響順序?yàn)椋禾崛r(shí)間>微波功率>乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比.用微波法從香菜中提取多酚的最佳工藝條件為：微波提取時(shí)間40 s，微波功率60 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶40.

準(zhǔn)確稱取香菜粉末2.0152 g,在2.2正交優(yōu)化的最佳工藝條件下，按1.4的方法測(cè)定吸光度，參照線性回歸方程，計(jì)算得出香菜中提取物多酚的含量為14.96 mg/g.

2.3 抑菌實(shí)驗(yàn)

以香菜提取液濃度為橫坐標(biāo)，抑菌圈(紫色為金黃色葡萄球菌，紅色為大腸桿菌)為縱坐標(biāo)作圖，如圖5所示.

圖5 香菜提取液的抑菌效果Fig. 5 The antibacterial effect ofcoriander extract

由圖5可以看出：香菜提取液對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有一定的抑制作用，抑制強(qiáng)度大小排序?yàn)椋簩?duì)金黃色葡萄球菌>對(duì)大腸桿菌；抑菌圈大小和濃度相關(guān).

3 結(jié)論

采用微波法提取香菜中的抗氧化劑多酚，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定了利用微波法提取香菜中多酚的最佳工藝條件為：提取時(shí)間40 s，微波功率60 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶40.在此提取工藝條件下，提取率高，香菜中的多酚含量為14.96 mg/g.香菜中多酚提取率的影響順序?yàn)椋何⒉〞r(shí)間>微波功率>乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比.微波時(shí)間和微波功率對(duì)多酚提取率的影響較大，在微波提取過(guò)程中，過(guò)長(zhǎng)的微波時(shí)間和過(guò)高的微波功率會(huì)造成溶劑揮發(fā)太多，所含多酚易被氧化分解，造成其中多酚提取率下降，所以不宜時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，功率不宜過(guò)高.抑菌實(shí)驗(yàn)表明香菜提取液對(duì)金黃色葡萄球菌、 大腸桿菌均有一定的抑制作用，對(duì)其他細(xì)菌的抑制作用有待進(jìn)一步探討.香菜中的抗氧化劑多酚的提取，具有很高的生產(chǎn)利用價(jià)值和應(yīng)用前景.