轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子BglR對東方肉座菌纖維素酶表達的影響

劉富川，薛 勇，劉 健，甘禮惠，龍敏南

(廈門大學能源學院，福建 廈門 361102)

天然纖維素是自然界儲量最豐富的可再生生物質(zhì)，是生物質(zhì)燃料的主要原料.纖維素的多種加工利用過程依賴于微生物，尤其是絲狀真菌，其在降解生物質(zhì)過程中形成了一種高效、復(fù)雜的機制用來分泌一組水解酶，對纖維素降解起主要作用[1].然而，目前高效分泌纖維素酶和半纖維素酶的絲狀真菌僅有少數(shù)，如里氏木霉(Trichodermareesei)等被開發(fā)應(yīng)用[2].

轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在絲狀真菌的纖維素酶表達調(diào)控過程中起關(guān)鍵作用.木聚糖基因調(diào)控因子xlnR是第一個被鑒定的轉(zhuǎn)錄因子[3]，也是纖維素利用過程中的重要調(diào)控因子，其同源序列存在于多數(shù)絲狀真菌中.在里氏木霉中，Xyr1可調(diào)控纖維素酶基因和半纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄[4].對黑曲霉(Aspergillusniger)和粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)中的CREA/1進行敲除[5]，可有效抑制碳源代謝阻遏，提高其纖維素酶基因和半纖維素酶基因在非誘導表達條件下的表達.另一個調(diào)控因子ACE1在里氏木霉和康氏木霉(T.koningii)中作為負調(diào)控因子，在槐糖和纖維素的誘導下，里氏木霉ACE1敲除菌株的主要纖維素酶基因和半纖維素酶基因表達量均有所提高[6].

東方肉座菌(T.orientalis) EU7-22是由本實驗室經(jīng)誘變、篩選獲得的木霉屬(Trichoderma)真菌，其不僅具有完整的纖維素酶系，而且與其他絲狀真菌相比具有較高的產(chǎn)纖維素酶能力，是一株具有工業(yè)化潛力的菌株，對其轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子進行研究具有重要意義.鋅指蛋白BglR是利用單核苷酸多態(tài)性檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)的特異性調(diào)控β-葡萄糖苷酶基因表達的轉(zhuǎn)錄因子[7].在里氏木霉中bglr基因的缺失可使其纖維素酶活力在碳源纖維二糖誘導下提高[7]，且其同源蛋白COL-26在粗糙脈孢菌的生物碳氮平衡中起調(diào)控作用[8].因此，本研究克隆獲得東方肉座菌的BglR缺失菌株，并對其產(chǎn)纖維素酶活力、蛋白分泌量和相關(guān)產(chǎn)酶基因的表達量進行分析，探究bglr基因在東方肉座菌中的功能，以期為進一步構(gòu)建高效降解纖維素的工業(yè)菌株提供理論參考.

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

東方肉座菌EU7-22菌株為本實驗室分離篩選獲得，大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α菌株也為本實驗室保存.pMD19-T載體質(zhì)粒購自寶生物工程(大連)有限公司；pUR5750質(zhì)粒為本實驗室保存，它帶有真菌篩選標記潮霉素抗性基因hph.

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉 10 g/L，pH 7.2.MM液體培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基)：葡萄糖20 g/L，硫酸銨5 g/L，磷酸二氫鉀15 g/L，硫酸鎂0.6 g/L，氯化鈣0.6 g/L.PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮，切塊)200 g 煮沸30 min后紗布過濾，將濾液定容至1 L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L.產(chǎn)酶培養(yǎng)基(質(zhì)量分數(shù))：微晶纖維素(PH101，優(yōu)普惠，深圳)1%，小麥麩皮1%，蛋白胨0.5%，氯化鈣0.05%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.25%，吐溫-80 0.4%(體積分數(shù)).上述化學藥品和試劑均為分析純，購自國藥化學試劑有限公司.

1.2 方 法

1.2.1 東方肉座菌基因組DNA、RNA的提取及cDNA的合成

將東方肉座菌接種至MM液體培養(yǎng)基中，置于溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min的搖床上培養(yǎng)48 h，過濾，收集菌絲，液氮研磨，使用CTAB法[9]提取基因組DNA,-20 ℃保存.用RNAiso Plus試劑(TaKaRa，日本)提取RNA，使用PrimeScript?RT試劑盒(TaKaRa，日本)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA.RNA與cDNA均置于-80 ℃保存.

1.2.2 bglr基因及其上下游序列的克隆

在NCBI數(shù)據(jù)庫(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)中將bglr基因與里氏木霉QM6a菌株(XM_006969261.1)、綠色木霉(T.virens)Gv29-8菌株(S. XM_014098216.1)和深綠木霉(T.atroviride)IMI 206040菌株(S. XM_014092063.1)的同源基因進行序列比對，選擇保守區(qū)序列設(shè)計引物bglr-F和bglr-R，以東方肉座菌基因組DNA為模板進行PCR擴增；膠回收產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，通過含有100 μg/mL氨芐青霉素的抗性LB平板篩選轉(zhuǎn)化子；再利用通用引物M13對獲得的陽性克隆子進行PCR檢測和測序，將所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對驗證.

對bglr基因上游未知序列進行克隆，簡并引物設(shè)計參照Liu等[10]的方法，設(shè)計bglr基因上游序列巢式引物bglr-U1、bglr-U2、bglr-U3(表1)，經(jīng)3次PCR反應(yīng)，對上游序列進行擴增，將所得產(chǎn)物進行回收轉(zhuǎn)化，對陽性克隆子篩選后進行測序.根據(jù)測序結(jié)果，進而設(shè)計上游巢式引物bglr-U11、bglr-U22、bglr-U33(表1)以得到足夠長的上游同源臂，并進行第2輪序列擴增，方法與上述步驟相同.交錯式熱不對稱PCR(TAIL-PCR)簡并引物SP1～4見表1.

借助bglr基因下游序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中的比對結(jié)果，根據(jù)其下游序列保守位點，設(shè)計下游簡并引物bglr-DF1和bglr-DR1(表1)，以東方肉座菌基因組DNA為模板進行PCR擴增，采用與上游同源臂相同的方法進行測序，得到東方肉座菌下游同源臂序列.

表1 本研究所用引物

Tab.1 Primers used in this study

引物名稱序列(5'→3')用途bglr-FCAGCTCTCATGCACCTACAATGbglr-RGCCGAAACCGTCAAAGATGbglr-U1TAAAGAACCTGCTGCTCGATGACGGbglr-U2ACGATGGACTCCAGTCCGGCCGAACGTGAGGCACTCCTTGACCATGbglr-U3AATGCGGTTATGGACCTTTGCGGCbglr-U11TGGGTCAGTCAGCAAGCGGAAGAGbglr-U22ACGATGGACTCCAGTCCGGCCCTCACGAGTTGCAGAGACGCTGAACGbglr-U33TCGCTTATTAGGCGGAGTCTGGGGTbglr-DF1TCMTCTCCGCVTWYGACCTSAGCGbglr-DR1CGCCTTTGCTCTTTGCTCGACATGTbglr基因及上下游未知序列克隆SP1ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVNVNNNGGAASP2ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBNBNNNGGTTSP3ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVVNVNNNCCAASP4ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBDNBNNNCGGTTAIL-PCRbglr-P1GCGTGCTGACCAGGTGAGATbglr-P2CATTGATGGATTCTGGCGTTATbglr-P3CGAAAGATCCCTGCAGGAAAGAAGCTGAGAGGCGACGATbglr-P4GGTAATCCTTCTTAAGCTTGGGCGGGCGAGCTCAACTTCAbglr-P5AAATCGCCAGCCTCTCCATbglr-P6GAGGTCGGCGAGATGCTCTACbglr-FATGACGTCGGCCGTCAAGCGCbglr-RCTACCGCAGTGTGTTGAAGTTGAGCPgpdA-yzCTATGCTCCAAGCTAGAGTCTCAGTtrpC-yzGAATCGGTCAATACACTACATGGCPgpdA-P2GATCTTTCGACACTGAAATACGTCTtrpC-P5AAGAAGGATTACCTCTAAACAAGTGhph-FCGACAGCGTCTCCGACCTGAhph-RCGCCCAAGCTGCATCATCGAA構(gòu)建Δbglr∷hph敲除盒以及Δbglr轉(zhuǎn)化子驗證18S rRNA-YGFAGGCGCGCAAATTACCCAATCC18S rRNA-YGRGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGbgl1-YGFATCACCTACCCGCCTTCAbgl1-YGRTCTCGTCGTCGGATGTTG實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

注：M=A/C，V=G/A/C，W=A/T，Y=C/T，S=G/C，B=G/T/C，D=G/A/T.

1.2.3 原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化

東方肉座菌中原生質(zhì)體的制備參照Szewczyk等[11]的方法，并適當優(yōu)化.將所得轉(zhuǎn)化子在潮霉素抗性平板上篩選，之后轉(zhuǎn)接至PDA固體培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)5 d；在潮霉素抗性培養(yǎng)基上劃線并得到單菌落，再轉(zhuǎn)接至PDA固體培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)5 d后提取基因組DNA，-20 ℃保存.

1.2.4 Δbglr∷hph 敲除盒的構(gòu)建

設(shè)計引物bglr-P1與bglr-P3、bglr-P4與bglr-P6(表1)，以東方肉座菌基因組DNA為模板進行PCR擴增并通過1%(質(zhì)量分數(shù)，下同)瓊脂糖凝膠電泳切膠回收，分別得到bglr基因的上、下游序列產(chǎn)物.以pUR5750質(zhì)粒為模板，利用引物PgpdA-P2與TtrpC-P5(表1)進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳切膠回收后得到潮霉素抗性基因表達盒.利用引物bglr-P2與bglr-P5(表1)，以3次PCR產(chǎn)物為模板進行融合PCR，瓊脂糖凝膠電泳切膠回收后獲得Δbglr∷hph敲除盒.

1.2.5 酶活力和蛋白含量測定

將菌株接種至PDA固體培養(yǎng)基上，30 ℃下培養(yǎng)5 d，將1.0 mL密度為107mL-1的孢子懸液接入50 mL種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18 h，然后按照體積比1∶10接種至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min的搖床上培養(yǎng)，每隔24 h取樣，6 000 r/min下離心10 min，收集上清酶液，測定酶活力[12-13].測定相關(guān)酶活力所用底物見表2，每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μmol還原糖或?qū)ο趸椒铀璧拿噶慷x為1個酶活力單位(IU).用改良型Bradford法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)測定酶液中的蛋白含量，方法參照試劑盒說明書.

表2 活力測定實驗的酶以及所用底物

Tab.2 Enzymes and substrates for activity assays

酶底物濾紙酶定量濾紙,Whatmanβ-葡萄糖苷酶水楊苷,Sigma內(nèi)切葡聚糖酶羧甲基纖維素鈉,國藥(分析純)外切葡聚糖酶對硝基苯纖維二糖苷,Sigma木聚糖酶木聚糖,甘蔗渣提取

1.2.6 轉(zhuǎn)化子菌落生長速度與表型分析

用ddH2O將孢子稀釋至107mL-1，點接1 μL于以2%(質(zhì)量分數(shù)，下同)葡萄糖、1%微晶纖維素、1%纖維二糖、2%羧甲基纖維素鈉分別作為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上，各3個平行平板.從培養(yǎng)36 h開始，每隔12 h測量菌落的直徑，連續(xù)培養(yǎng)4 d后觀察菌落生長表型.

1.2.7 qRT-PCR

分別取培養(yǎng)48和72 h后的發(fā)酵液，4 000 r/min離心5 min獲得菌絲體，稱取200 mg加入液氮研磨，用RNAiso Plus試劑從原始菌和Δbglr敲除菌中提取RNA，用PrimeScript?RT 試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以18SrRNA基因為內(nèi)參，采用嵌合染料SYBR Green Ⅰ進行qRT-PCR,分析目的基因的相對表達量[14],所用引物見表1.

圖1 基因bglr(a)及其編碼蛋白BglR保守區(qū)(b)的示意圖Fig.1 Sketch maps of bglr gene(a) and the conservative domain in BglR(b)

2 結(jié)果與分析

2.1 東方肉座菌bglr基因克隆及生物信息學分析

用DNAMAN軟件將測序結(jié)果進行拼接，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行核酸序列比對，在東方肉座菌中得到了總長度為5 878 bp的基因序列，包括bglr基因編碼序列2 204 bp(包含1個位于784～839 bp的內(nèi)含子)、上游同源臂序列1 671 bp和下游同源臂序列2 003 bp；使用Primer Premier 5.0軟件將其翻譯為715個氨基酸殘基的蛋白序列，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行蛋白序列比對，發(fā)現(xiàn)該蛋白屬于Zn(Ⅱ)2C6型鋅指蛋白(圖1).將東方肉座菌bglr基因序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(登錄號MG720023).

采用鄰接(neighbor-jointing)法使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,結(jié)果表明bglr基因在真菌中具有較高的同源性(圖2)，其中與里氏木酶的同源性為87%，與Isariafumosorosea的同源性為77%，與Purpureocilliumlilacinum的同源性為69%.轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在絲狀真菌產(chǎn)纖維素酶過程中起關(guān)鍵作用，但僅有少數(shù)調(diào)控因子(如碳阻遏代謝調(diào)控因子Cre1/A)的保守序列存在于整個真菌家族中，而大多數(shù)僅限于真菌種類的亞群[1].轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子BglR在真菌中廣泛存在，但BglR在不同菌株中表現(xiàn)出的功能也不同，例如在里氏木霉中正向調(diào)控β-葡萄糖苷酶活力[7]，而在斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)中則對該酶活力起負調(diào)控作用[15].

2.2 Δbglr敲除盒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化子驗證

以東方肉座菌基因組DNA為模板用引物bglr-P1與bglr-P3克隆得到大小為2 069 bp的上游同源臂，用bglr-P4與bglr-P6得到大小為1 994 bp的下游同源臂；進而用引物bglr-P2與bglr-P5，以上、下游同源臂片段和潮霉素表達盒為模板進行融合PCR，得到大小為8 047 bp的Δbglr∷hph敲除盒(圖3).

圖2 東方肉座菌bglr基因的系統(tǒng)進化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of the bglr gene in T. orientalis

圖3 Δbglr∷hph敲除盒構(gòu)建及轉(zhuǎn)化子PCR驗證引物示意圖Fig.3 Schematic map of constructing Δbglr∷hph deletion cassette and primers for PCR identification of the Δbglr transformant

(a) 驗證bglr基因序列；(b) 驗證hph基因序列；(c) Δbglr∷hph 敲除盒上游定位；(d) Δbglr∷hph 敲除盒下游定位.M.DNA分子質(zhì)量標準，(a)中為1 000 bp，(b)～(d)中為5 000 bp；1.EU7-22原始菌；2.Δbglr轉(zhuǎn)化子.圖4 Δbglr轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳驗證Fig.4 PCR products verification of the Δbglr transformant by agarose gel electrophoresis

將潮霉素抗性平板篩選得到的轉(zhuǎn)化子分別以原始菌EU7-22和轉(zhuǎn)化子Δbglr的基因組DNA作為模板，用引物hph-F與hph-R進行PCR，在轉(zhuǎn)化子Δbglr中檢測到大小約為811 bp的潮霉素抗性基因片段，而EU7-22中并無條帶出現(xiàn)，證明敲除盒成功轉(zhuǎn)入(圖4(a)).用引物Cbglr-F和Cbglr-R對轉(zhuǎn)化子bglr基因進行擴增驗證，結(jié)果如圖4(b)所示,在原始菌EU7-22中，擴增出bglr基因條帶(長度2 204 bp)，而轉(zhuǎn)化子Δbglr中相同位置未出現(xiàn)該條帶，說明bglr基因在轉(zhuǎn)化子中成功敲除.用引物bglr-P1與PgpdA-yz進行PCR擴增定位，結(jié)果如圖4(c)所示，在轉(zhuǎn)化子Δbglr中擴增出長度為2 933 bp的條帶，在原始菌EU7-22中相同條件下相同位置沒有出現(xiàn)相應(yīng)的條帶，可見敲除盒在bglr基因上游區(qū)域發(fā)生了同源重組.類似地，用引物bglr-P6與TtrpC-yz進行PCR擴增定位，結(jié)果如圖4(d)所示，在轉(zhuǎn)化子Δbglr中擴增出長度為3 316 bp的條帶，而原始菌EU7-22中未出現(xiàn)相同條帶，說明敲除盒在bglr基因下游區(qū)域插入位點正確.經(jīng)驗證，敲除盒成功導入到轉(zhuǎn)化子Δbglr并且產(chǎn)生了雙同源交換，即得Δbglr突變菌.

(a) 濾紙酶活力；(b) 內(nèi)切葡聚糖酶活力；(c) β-葡萄糖苷酶活力；(d) 外切葡聚糖酶活力；(e) 木聚糖酶活力；(f) 蛋白含量.圖5 東方肉座菌EU7-22和Δbglr突變菌的酶活力與蛋白含量Fig.5 Enzyme activities and protein concentrations in T. orientalis EU7-22 and the Δbglr mutant

2.3 Δbglr突變菌產(chǎn)酶和蛋白含量的變化

以1%微晶纖維素和1%麩皮作為產(chǎn)酶培養(yǎng)基的誘導物，分別培養(yǎng)原始菌EU7-22和突變菌Δbglr，每隔24 h取發(fā)酵液測定酶活力和蛋白含量，共培養(yǎng)5 d，每個時間點取3個平行樣.如圖5所示，突變菌Δbglr的濾紙酶、外切葡聚糖酶、木聚糖酶活力及蛋白含量的最高值分別升高39%，22%，16%和20%，β-葡萄糖苷酶活力下降47%，而內(nèi)切酶活力無明顯變化.這表明BglR對東方肉座菌的β-葡萄糖苷酶活力起正調(diào)控作用，使水解產(chǎn)物減少，減小了代謝系統(tǒng)中葡萄糖的反饋抑制作用，進而使其他酶的活力升高.

圖6 qRT-PCR分析bgl1基因表達量Fig.6 qRT-PCR analysis of the bgl1 gene expression

2.4 β-葡萄糖苷酶基因表達的qRT-PCR分析

在1%微晶纖維素和1%麩皮的誘導下，利用qRT-PCR分析原始菌EU7-22與突變菌Δbglr中主要β-葡萄糖苷酶基因bgl1的表達量，以內(nèi)參基因18SrRNA校正，結(jié)果顯示原始菌發(fā)酵培養(yǎng)48和72 h后的表達量分別為突變菌的6.89倍和10.41倍(圖6).該結(jié)果與突變菌的β-葡萄糖苷酶活力較原始菌降低(圖5(c))相吻合，說明BglR對東方肉座菌bgl1基因的表達起正調(diào)控作用.

2.5 發(fā)酵液pH值變化分析

對菌株EU7-22和Δbglr在不同時間段發(fā)酵液的pH值進行測定，結(jié)果如圖7所示，兩菌株的發(fā)酵液pH值變化曲線差異明顯：原始菌EU7-22發(fā)酵液的pH值在24 h時下降到最低值4.6，后隨發(fā)酵時間增加而逐漸升高，在120 h時達到6.6；而突變菌Δbglr發(fā)酵液的pH值先升高，然后快速降低，在72 h時達到最低值4.7，后隨發(fā)酵時間逐漸升高，在120 h時與原始菌EU7-22發(fā)酵液趨近一致.由此可見BglR的缺失對東方肉座菌發(fā)酵過程中的pH環(huán)境產(chǎn)生了影響，推測與其有機酸代謝變化相關(guān).

圖7 東方肉座菌EU7-22與Δbglr突變菌發(fā)酵液的pH值變化Fig.7 The supernatant pH value changes of T. orientalis EU7-22 and the Δbglr mutant

2.6 菌落生長速率測定和表型分析

研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子BglR的缺失對菌落生長的影響，分別以2%葡萄糖、1%纖維二糖、1%微晶纖維素、2%羧甲基纖維素鈉作為碳源，培養(yǎng)4 d后對其表型進行觀察，結(jié)果如圖8所示,在4種培養(yǎng)基上突變菌Δbglr產(chǎn)孢子量均明顯少于原始菌EU7-22.進而測定并比較在相同碳源平板上生長的兩菌株的菌落直徑生長速率，結(jié)果如圖9所示，突變菌Δbglr的菌落直徑生長速率均小于原始菌EU7-22.以上數(shù)據(jù)表明，BglR的缺失對東方肉座菌的生長產(chǎn)生了明顯影響.由于微晶纖維素無法溶解，在培養(yǎng)基中分散不夠均勻，難以直接測量菌落直徑，因此未給出定量數(shù)據(jù).

圖8 東方肉座菌 EU7-22 與 Δbglr 突變菌在不同碳源平板上的產(chǎn)孢子分析Fig.8 Analysis on spores production of T. orientalis EU7-22 and the Δbglr mutant with different carbon resources

圖9 東方肉座菌EU7-22與Δbglr突變菌在不同碳源平板上的菌落生長速率Fig.9 The colony growth rates of T. orientalis EU7-22 and the Δbglr mutant on different carbon resource plates

3 討 論

為研究BglR對東方肉座菌產(chǎn)酶特性的影響，根據(jù)在GenBank中比對的絲狀真菌bglr基因的保守序列設(shè)計簡并引物，得到了東方肉座菌bglr基因的部分序列；進而通過TAIL-PCR對bglr基因上、下游未知序列進行擴增，克隆出包括上、下游同源臂在內(nèi)的bglr基因序列.通過同源重組雙交換方式得到了BglR缺失突變菌株Δbglr，并驗證了調(diào)控因子BglR的缺失對產(chǎn)酶活力和蛋白分泌量的影響，以及不同碳源對菌株生長的影響.

纖維素酶活力測定結(jié)果表明，bglr基因的缺失可使東方肉座菌的濾紙酶、外切葡聚糖酶、木聚糖酶活力和蛋白含量上升，而使β-葡萄糖苷酶活力下降.對β-葡萄糖苷酶編碼基因bgl1表達水平的檢測結(jié)果表明，突變菌Δbglr中的表達量較原始菌顯著降低.此外，BglR的缺失對東方肉座菌在不同碳源培養(yǎng)基上的生長均造成了影響.β-葡萄糖苷酶屬糖苷水解酶，在碳阻遏代謝過程中對纖維素的水解起關(guān)鍵作用，是纖維素水解過程中的限速酶.在纖維素水解過程中，先由內(nèi)切葡聚糖酶與外切葡聚糖酶協(xié)同產(chǎn)生纖維二糖，而后纖維二糖被β-葡萄糖苷酶徹底水解成葡萄糖[16].微生物在生長代謝過程中會優(yōu)先利用環(huán)境中葡萄糖，當葡萄糖的量降低時，纖維素酶的生產(chǎn)得到激發(fā)，從而實現(xiàn)對纖維素的降解.因此，本研究通過對突變菌Δbglr的酶活力進行分析，發(fā)現(xiàn)BglR在東方肉座菌中正調(diào)控β-葡萄糖苷酶.由于BglR的缺失，阻礙了菌株利用纖維素/纖維二糖等碳源的生長，進一步證明了轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子BglR作為一個主要的潛在產(chǎn)糖信號，調(diào)控碳阻遏代謝循環(huán).濾紙酶活力代表纖維素酶的3種酶組分協(xié)同作用后的總酶活[17]，均相水溶性纖維素的水解速度高于非均相不溶性纖維素，其水解底物又依賴于不溶性纖維素的水解產(chǎn)物，因此不溶性纖維素水解是影響濾紙酶活力的限速步驟[18].本研究中BglR的缺失導致東方肉座菌β-葡萄糖苷酶活力降低，從而使誘導物纖維寡糖含量相對升高，繼而造成降解不溶性纖維素的外切葡聚糖酶活力升高，導致濾紙酶活力的增加.誘導物的增加也促使了木聚糖酶表達量增加，同時胞外蛋白量的增加，側(cè)面驗證了胞外酶量的增加.

本實驗室前期已對相關(guān)產(chǎn)酶基因的功能進行了研究和鑒定[19-22]，目前東方肉座菌的全基因組測序工作正在進行中.本研究揭示了東方肉座菌中BglR調(diào)控纖維菌酶生產(chǎn)相關(guān)的功能，對進一步完善其纖維素酶基因的表達調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)，為利用分子生物學方法構(gòu)建新的高效產(chǎn)纖維素酶工業(yè)菌株提供了參考.