日本鰻鱺γ-干擾素誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶(GILT)基因的克隆鑒定與表達(dá)分析

陳 姍，張芳芳，黃 貝，黃文樹(shù)，3*

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，2.鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心(集美大學(xué))，3.福建省海洋生物資源開(kāi)發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門(mén) 361021)

γ-干擾素誘導(dǎo)的溶酶體巰基還原酶(interferon-γ-inducible lysosomal thiol reductase，GILT)最初在人的單核細(xì)胞系U937中被發(fā)現(xiàn)[1]，它首先被合成為一個(gè)35 ku的蛋白前體，然后通過(guò)甘露糖-6-磷酸受體(mannose 6-phosphate receptor)運(yùn)輸?shù)桨掏分衃2-4]，被溶酶體中的蛋白酶將其N(xiāo)端和C端前肽切除，形成一個(gè)30 ku的成熟肽[5-6].GILT的前體和成熟肽都具有還原二硫鍵的作用，且在pH 4.5～5.5的酸性條件下可發(fā)揮最佳效果[2-3，7].脊椎動(dòng)物GILT蛋白的典型特征包括1個(gè)CQHGX2ECX2NX4C特征序列、1個(gè)CXXC活化位點(diǎn)、1個(gè)以上天冬氨酸殘基連接的糖基化位點(diǎn)(Asn-linked glycosylation site)和10～11個(gè)保守的半胱氨酸殘基[8-10].

GILT在大多數(shù)的抗原遞呈細(xì)胞(如單核/巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞)中呈組成型表達(dá)，而在其他細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞、表皮細(xì)胞、角化細(xì)胞)中可被γ-干擾素誘導(dǎo)[1-3，8，10].除了與抗原遞呈有關(guān)，GILT也與負(fù)調(diào)控T細(xì)胞活化、中和胞外病原和清除細(xì)菌感染所造成的細(xì)胞碎片有關(guān)[11-12].此外，還有研究發(fā)現(xiàn)除了γ-干擾素，在PMA(phorbol-12-myristate-13-acetate)和脂多糖(LPS)的誘導(dǎo)作用下可促使THP-1細(xì)胞分泌促炎癥細(xì)胞因子和趨化因子，其中包括GILT[12-13].

目前GILT基因在無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中均有報(bào)道.有研究顯示，在魚(yú)類(lèi)中GILT基因主要在脾臟和腎臟中表達(dá)量最高，且經(jīng)LPS或細(xì)菌刺激后其mRNA表達(dá)水平上調(diào)，這表明GILT可能在對(duì)細(xì)菌感染后宿主的免疫應(yīng)答中有重要作用[14-15].日本鰻鱺(Anguillajaponica)是世界性的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)，但在其養(yǎng)殖過(guò)程中，細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、真菌和病毒性疾病的發(fā)生會(huì)給鰻鱺養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的損失[16].GILT是與免疫相關(guān)的基因，但鰻鱺中對(duì)其特征和功能卻未有報(bào)道.本研究克隆了日本鰻鱺GILT基因(AjGILT)的基因組和啟動(dòng)子序列，并通過(guò)生物信息學(xué)方法分析了其編碼蛋白的序列特征；在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了其在日本鰻鱺不同組織中的表達(dá)情況，以及LPS、聚肌胞苷酸(PolyI：C)刺激和遲緩愛(ài)德華氏菌(Edwardsiellatarda)感染不同時(shí)間后在不同組織中的表達(dá)變化，以期為了解AjGILT的功能奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材 料

日本鰻鱺，體質(zhì)量為(200±53) g，來(lái)源于福建省廈門(mén)市集美大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地；遲緩愛(ài)德華菌為集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存菌種.

1.2 AjGILT基因的cDNA序列克隆

用Trizol?RNA提取試劑提取總RNA，經(jīng)無(wú)RNase的DNaseⅠ處理后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒GoScriptTMReverse Transcription System(Promega，美國(guó))制備cDNA模板，用SMART RACE試劑盒(Clontech，美國(guó))制備5′-和3′-cDNA末端快速克隆(RACE)模板.設(shè)計(jì)RACE PCR引物(表1)，分別擴(kuò)增AjGILT-1和AjGILT-2的5′-和3′-端序列.PCR擴(kuò)增條件為：第一輪94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min.第二輪94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，38個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min.用引物AjGILT-1fl-F、AjGILT-1fl-R和AjGILT-2fl-F、AjGILT-2fl-R(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別驗(yàn)證AjGILT-1和AjGILT-2的開(kāi)放閱讀框(open reading frame，ORF)序列.PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；然后94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，38個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min.擴(kuò)增所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，E.Z.N.A凝膠回收試劑盒(Omega，美國(guó))回收目的條帶，然后連接到pMD19-T載體(TaKaRa，日本)上，并通過(guò)熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(Escherichcoli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，最后篩選陽(yáng)性克隆并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證.

1.3 AjGILT的基因組和啟動(dòng)子序列克隆

取日本鰻鱺肌肉組織100 mg，經(jīng)酚/三氯甲烷/異戊醇法提取基因組DNA.以基因組DNA為模板，用引物AjGILT-1fl-F、AjGILT-1fl-R和AjGILT-2fl-F、AjGILT-2fl-R(表1)分別擴(kuò)增AjGILT-1和AjGILT-2的基因組序列.PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s，62 ℃退火10 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min.

以日本鰻鱺基因組DNA為模板，用引物AjGILT-1pF、AjGILT-1pR和AjGILT-2pF、AjGILT-2pR(表1)分別擴(kuò)增AjGILT-1和AjGILT-2的啟動(dòng)子序列.PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60/58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，38個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min.

1.4 AjGILT基因的表達(dá)分析

樣品采集[17]：日本鰻鱺經(jīng)丁香酚及冰水麻醉后，斷尾取血于加有肝素鈉的離心管中，混勻，800g離心20 min，收集下層細(xì)胞，-80 ℃保存?zhèn)溆?；然后解剖采集肝臟、脾臟、腸、皮膚、胃、頭腎、中腎、鰾和鰓等組織/器官，分別于液氮冷凍后-80 ℃保存.

誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)：分別設(shè)置磷酸鹽緩沖液(PBS)對(duì)照組、LPS(Sigma，美國(guó))刺激組(劑量為1 mg/100 g)、Poly I：C(Sigma，美國(guó))刺激組(劑量為1 mg/100 g)、遲緩愛(ài)德華氏菌感染組(劑量為107cfu/100 g，cfu表示菌落形成單位)，腹腔注射.注射8，16，24和72 h后采樣，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各采集6尾.

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)：根據(jù)已獲得的AjGILT-1和AjGILT-2的cDNA序列和基因組序列比對(duì)結(jié)果，設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子區(qū)域的AjGILT-1和AjGILT-2擴(kuò)增引物，分別為qAjGILT-1F、qAjGILT-1R和qAjGILT-2F、qAjGILT-2R(表1);同時(shí)以β-actin(GenBank：GU001950.1)為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)引物Actin178F2和Actin178R2(表1).以日本鰻鱺cDNA 為模板，PCR擴(kuò)增AjGILT-1、AjGILT-2以及β-actin基因片段，回收目的片段進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化和克隆鑒定后測(cè)序;再將測(cè)序正確的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，測(cè)定質(zhì)粒濃度并以其為原液用滅菌水進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)肔ightCycler?480 SYBR Green試劑盒(Roche，德國(guó))擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;然后在每塊96孔板中加入4～5個(gè)已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒樣品，剩余孔加入未知樣品.PCR程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min；95 ℃ 20 s，62 ℃ 20 s，72 ℃ 25 s，共40個(gè)循環(huán).AjGILT-1和AjGILT-2的采集點(diǎn)溫度分別為83和81 ℃.反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算未知樣品的拷貝數(shù).

表1 本研究中使用的引物

Tab.1 Primers used in this study

引物名稱(chēng)序列 (5'→3')用途UPMCTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTRACENUPMACTCTGCGTTGATACCACTGCTTAjGILT-1F1GGTTCTGAAGCAGTGTATGGAGCAjGILT-1的3'-RACEAjGILT-1F2ATGTGACGGTTGGGCTGTACTATGAGAGAjGILT-1R1GCTACAGACCAGGGTGAAGAGAGATGACAjGILT-1的5'-RACEAjGILT-1R2TGGTCTCCCACTTCACAGAAGGAGCATAAjGILT-1fl-FTACGCAGTTGGGAGCTAAAjGILT-1序列驗(yàn)證AjGILT-1fl-RGGATGCCATAGGAGACAGACAAjGILT-2F1ACGGAATGGTGTAGGACTCAAGAGATCGAjGILT-2的3'-RACEAjGILT-2F2CCAGCATGGAGAAGAGGAATGTTTGGGAjGILT-2R1GGCAGCAGGCTTGGGTCCCTTATACAAjGILT-2的5'-RACEAjGILT-2R2CACGTACTTGTGCGGCGGGTTCAAjGILT-2fl- FGAGCTAAGCAGTCTATAGCCAjGILT-2序列驗(yàn)證AjGILT-2fl- RGTCAGTGATAGTGTTGGTGGATAjGILT-1pFAACCCTATCTAGTTCAAGAG啟動(dòng)子序列擴(kuò)增AjGILT-1pRGCATTCCATAGCTATTTCCAjGILT-2pFAGCAGGGTTGTGTTCATGACAjGILT-2pRGCATTCTCTGGCGATCTCqAjGILT-1FAACGCCGAGGAGACCGAGCqRT-PCRqAjGILT-1RCTCCGTGTGCTCCCCATTGATGqAjGILT-2FGGGTTGAGAAGTATTGCCTGGAqAjGILT-2RGAGGACACACGCCTCGATCATAActin178F2TCACCACCACAGCCGAAAGGActin178R2CGCAGGATTCCATTCCCAGGA

1.5 序列分析和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

在NCBI網(wǎng)站(http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行序列比對(duì)分析；用ExPASy工具(http：∥web.expasy.org/)翻譯氨基酸序列和分析蛋白質(zhì)功能域；用SignalP 4.1 Server (http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析信號(hào)肽序列；用NetNGlyc 1.0 Server (http：∥www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc)分析糖基化位點(diǎn)；用NNPP工具 (http：∥www.fruitfly.org/seq/tools/promoter.html)預(yù)測(cè)基因調(diào)控區(qū)域；用Promoter 2.0 (http：∥www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；用調(diào)控元件結(jié)合位點(diǎn)分析網(wǎng)站 (http：∥www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html)分析基因啟動(dòng)子序列中潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；用ClustalW 1.83和MEGA 5.0軟件比較氨基酸序列同源性和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù).數(shù)據(jù)用Excel 2010進(jìn)行計(jì)算，用單因素方差分析法(one-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用Dunnettt-檢驗(yàn)(雙尾)進(jìn)行多重比較.所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示，p<0.05表示差異顯著，p<0.01表示差異極顯著.用GraphPad Prism v5.0軟件作圖.

虛線表示預(yù)測(cè)的信號(hào)肽序列，橢圓框表示活性位點(diǎn)CXXC，陰影表示保守的半胱氨酸殘基，方框表示糖基化位點(diǎn)，單下劃線表示特征序列CQHGX2ECX2NX4C，雙下劃線表示終止信號(hào)(AATAAA).圖1 AjGILT-1(a)和AjGILT-2(b)的cDNA及預(yù)測(cè)的氨基酸序列Fig.1 cDNA and predicted amino acid sequences of AjGILT-1(a) and AjGILT-2(b)

2 結(jié)果與分析

2.1 AjGILT基因的鑒定及特征分析

如圖1所示：AjGILT-1和AjGILT-2的cDNA序列全長(zhǎng)分別為840 bp和1 110 bp，編碼蛋白分別含260和255個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)其分子質(zhì)量大小分別為29.11和28.15 ku，等電點(diǎn)分別為5.56和6.31.其中AjGILT-2含有保守的終止信號(hào)(AATAAA)和polyA序列.氨基酸序列分析結(jié)果顯示AjGILT-1和AjGILT-2均含有特征序列CQHGX2ECX2NX4C，分別位于124～139位和117～132位氨基酸殘基；活性位點(diǎn)CXXC，分別位于79～82和72～75位氨基酸殘基；2個(gè)糖基化位點(diǎn)，分別為N58、N68和N51、N135；11個(gè)保守的半胱氨酸殘基，預(yù)測(cè)可形成5個(gè)二硫鍵；N端分別含有21和22個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽.

克隆獲得AjGILT-1和AjGILT-2的基因組序列全長(zhǎng)分別為4 657 bp和4 452 bp.與AjGILT-1和AjGILT-2的cDNA序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)AjGILT-1和AjGILT-2基因組序列均含有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子(圖2),與其他脊椎動(dòng)物(人、鼠、斑馬魚(yú)、大黃魚(yú)等)的GILT基因結(jié)構(gòu)[18]相似.

線條表示內(nèi)含子，方框表示外顯子，數(shù)字表示各外顯子起止堿基的位置.圖2 AjGILT-1(a)和AjGILT-2(b)的基因組序列結(jié)構(gòu)Fig.2 The genomic sequence structures of AjGILT-1(a) and AjGILT-2(b)

2.2 AjGILT氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

將AjGILT-1和AjGILT-2與其他物種GILTs的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果表明它們?cè)诘鞍滋卣鹘Y(jié)構(gòu)上高度保守(附錄圖S1，http：∥jxmu. xmu.edu.cn/upload/html/20180408.html).AjGILT-1與所比對(duì)的其他物種GILTs的氨基酸序列相似性為31%～63%，其中與大西洋鮭(Salmosalar)的相似性最高;而AjGILT-2與所比對(duì)的其他物種GILTs的氨基酸序列相似性為29%～62%，其中與虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的相似性最高.系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示：所選的GILT家族蛋白被分為脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物兩大類(lèi)，且在進(jìn)化過(guò)程中來(lái)源于一個(gè)共同的祖先；其中AjGILT-1與AjGILT-2聚為一支，兩者又與大西洋鮭和虹鱒的GILTs聚為一支，表明親緣關(guān)系較近(圖3).

2.3 AjGILT啟動(dòng)子序列分析

AjGILT-1與AjGILT-2啟動(dòng)子分析結(jié)果表明兩者均存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，包括γ-干擾素活化序列(γ-interferon activation site，GAS)、特化蛋白1(specificity protein 1，Sp1)、轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT enhancer binding protein，C/EBP)等.不同的是AjGILT-1啟動(dòng)子區(qū)存在多個(gè)核因子-1(nuclear factor-1，NF-1)、激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)結(jié)合位點(diǎn)及干擾素刺激反應(yīng)元件(interferon stimulation reaction element，ISRE)，而在AjGILT-2啟動(dòng)子區(qū)未發(fā)現(xiàn)(圖4).

2.4 AjGILT基因在不同組織/器官中的表達(dá)

利用qRT-PCR檢測(cè)AjGILT-1和AjGILT-2在健康日本鰻鱺的肝臟、脾臟、胃、血液、頭腎、中腎、鰓、腸、心臟、尾鰭、性腺、鰾、肌肉和皮膚共14個(gè)組織/器官中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示(圖5)：AjGILT-1和AjGILT-2在所檢測(cè)的組織/器官中均有表達(dá)；AjGILT-1在鰓和腸中表達(dá)量最高，其次為頭腎、中腎、鰾、皮膚、血液、性腺及肌肉，在肝臟、尾鰭和胃中的表達(dá)量極低；而AjGILT-2在性腺、頭腎和脾臟中表達(dá)量最高，其次為鰓、中腎、肌肉和心臟，在尾鰭和胃中表達(dá)量最低；此外，在性腺、脾臟、鰓、中腎、肝臟和胃中AjGILT-2的表達(dá)量都顯著高于AjGILT-1.

2.5 LPS、PolyI：C刺激及E.tarda感染后AjGILT基因的表達(dá)變化

通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)LPS、PolyI：C刺激以及E.tarda感染8，16，24和72 h后，AjGILT-1和AjGILT-2在日本鰻鱺的鰓、頭腎和中腎中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖6所示.

AjGILT-1和AjGILT-2用▲標(biāo)記，物種名后為各GILT對(duì)應(yīng)的GenBank登錄號(hào).圖3 采用鄰接法構(gòu)建的AjGILT-1、AjGILT-2與其他物種GILTs的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of AjGILT-1，AjGILT-2 and other GILTs using neighbor joining method

圖4 AjGILT-1(a)和AjGILT-2(b)的啟動(dòng)子序列分析Fig.4 Analysis of promoter sequences of AjGILT-1(a) and AjGILT-2(b)

同一組織/器官中兩基因比較，*p< 0.05，**p<0.01(下同).圖5 AjGILT-1和AjGILT-2在日本鰻鱺不同組織/器官中的表達(dá)譜Fig.5 Expression profile of AjGILT-1 and AjGILT-2 in different tissues/organs of A. japonica

在LPS刺激后，鰓中AjGILT-1的表達(dá)量在刺激8 h后有一定程度上調(diào)，之后恢復(fù)，但均無(wú)顯著性差異；AjGILT-2的表達(dá)量在刺激24 h后有一定程度上調(diào)，但在72 h后又顯著下調(diào).頭腎中AjGILT-1和AjGILT-2的表達(dá)量在刺激8 h后均顯著下調(diào)，之后維持在較低水平.中腎中AjGILT-1的表達(dá)量在刺激8 h后顯著下調(diào)，之后逐漸恢復(fù)；而AjGILT-2的表達(dá)量在刺激8 h后無(wú)顯著變化，但在16 h后顯著下調(diào)，之后維持在較低水平.

在PolyI：C刺激后，鰓中AjGILT-1的表達(dá)量?jī)H在刺激24 h后顯著下調(diào)，而AjGILT-2的表達(dá)量?jī)H在刺激16 h后顯著上調(diào).頭腎中AjGILT-1的表達(dá)量在刺激24 h后顯著下調(diào)，但在72 h后又有一定程度上調(diào)；而AjGILT-2表達(dá)量在刺激16 h后有一定程度上調(diào)，但在72 h后顯著下調(diào).中腎中AjGILT-1和AjGILT-2的表達(dá)量均在刺激24 h后顯著下調(diào)，之后恢復(fù).

在E.tarda感染后，鰓中AjGILT-1的表達(dá)量在感染8 h后有一定程度下調(diào)，16 h后有一定程度上調(diào)，之后恢復(fù)，但均無(wú)顯著性差異；而AjGILT-2的表達(dá)量?jī)H在感染16 h后顯著上調(diào).頭腎中AjGILT-1的表達(dá)量在感染24 h后顯著下調(diào)，之后維持在較低水平；而AjGILT-2的表達(dá)量在感染16 h后有一定程度上調(diào)，但在72 h后又顯著下調(diào).中腎中AjGILT-1的表達(dá)量在感染16 h后顯著下調(diào)，AjGILT-2的表達(dá)量在感染24 h后顯著下調(diào)，之后均維持在較低水平.

3 討論與結(jié)論

本研究在日本鰻鱺中克隆獲得AjGILT-1和AjGILT-2基因，cDNA序列全長(zhǎng)分別為840 bp 和1 110 bp，編碼蛋白均含有GILT家族的特征序列CQHGX2ECX2NX4C、活性位點(diǎn)CXXC、2個(gè)糖基化位點(diǎn)及11個(gè)保守的半胱氨酸殘基.其中活性位點(diǎn)CXXC是使巰基還原酶有活性和維持GILT結(jié)構(gòu)和功能所必需的，且CXXC中任何一個(gè)半胱氨酸殘基的突變均可使GILT的巰基還原酶失活[2].AjGILT的2個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)可能由甘露糖-6-磷酸衍生而來(lái)，其在酸性條件下對(duì)GILT前體轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體中是必需的[19].此外，保守的半胱氨酸殘基可形成二硫鍵，Collins等[6]提出在含有高濃度半胱氨酸的條件下，可最大程度催化溶酶體中二硫化物的還原.因此，AjGILT的功能可能涉及高濃度半胱氨酸的二硫鍵還原，進(jìn)而在調(diào)節(jié)抗原遞呈和表位選擇中發(fā)揮作用[5].

γ-干擾素發(fā)揮作用是在JAK-STAT信號(hào)通路中形成STAT1磷酸化同源二聚體，然后進(jìn)入細(xì)胞核并通過(guò)結(jié)合目的基因啟動(dòng)子區(qū)的GAS來(lái)激活目的基因的轉(zhuǎn)錄[9].目前研究表明人類(lèi)黑素瘤中γ-干擾素誘導(dǎo)的GILT基因表達(dá)取決于STAT1的活化，活化的STAT1通過(guò)結(jié)合GILT啟動(dòng)子中的GAS進(jìn)而調(diào)節(jié)GILT基因表達(dá)[20].在斑節(jié)對(duì)蝦GILT基因的研究中，發(fā)現(xiàn)其通過(guò)JAK-STAT信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)病毒感染后的一部分免疫應(yīng)答[21].本研究結(jié)果顯示AjGILT-1和AjGILT-2啟動(dòng)子區(qū)均含有GAS，因此推測(cè)AjGILT-1和AjGILT-2在病毒感染后的免疫應(yīng)答中也可能通過(guò)JAK-STAT信號(hào)通路發(fā)揮作用.

圖6 LPS、PolyI：C刺激及E.tarda感染后鰓、頭腎和中腎中AjGILT-1(a)和AjGILT-2(b)的表達(dá)變化Fig.6 The expression changes of AjGILT-1(a) and AjGILT-2(b) after LPS，PolyI：C stimulation and E. tarda infection in gill，head kidney and middle kidney

目前在大黃魚(yú)[9]、斜帶石斑魚(yú)[22]、斑馬魚(yú)[23]、加州鱸[14]、暗紋東方鲀[18]、虹鱒[24]、金魚(yú)[15]、鱖魚(yú)[25]中檢測(cè)GILT基因的組織表達(dá)，結(jié)果顯示其均在脾臟和腎臟中表達(dá)最高；在文昌魚(yú)中，GILT基因在消化系統(tǒng)中表達(dá)最高[10].在皺紋盤(pán)鮑中，GILT基因在鰓、外殼膜和消化道組織中呈組成型表達(dá)[19].在合浦珠母貝中，GILT基因在鰓和消化腺中表達(dá)最高[26].本研究中AjGILT-1和AjGILT-2在檢測(cè)的14個(gè)組織中均有表達(dá)，AjGILT-1在鰓和腸中表達(dá)量最高，而AjGILT-2在性腺、頭腎和脾臟中表達(dá)量最高.這表明GILT基因在不同物種中的組織表達(dá)水平上存在差異.

本研究結(jié)果顯示：LPS刺激后，鰓中AjGILT-1的表達(dá)量無(wú)顯著變化，而AjGILT-2在刺激72 h后顯著下調(diào)；頭腎和中腎中AjGILT-1和AjGILT-2的表達(dá)量均顯著下調(diào).PolyI：C刺激后，鰓中AjGILT-1和AjGILT-2表達(dá)量在刺激16 h后有一定程度上調(diào)；頭腎中AjGILT-1的表達(dá)量在刺激24 h后顯著下調(diào)，AjGILT-2的表達(dá)量在刺激72 h后顯著下調(diào)；中腎中AjGILT-1和AjGILT-2的表達(dá)量均在刺激24 h后顯著下調(diào).E.tarda感染后，鰓中AjGILT-1和AjGILT-2的表達(dá)量在16 h后上調(diào)；頭腎中AjGILT-1的表達(dá)量在24 h后顯著下調(diào)，AjGILT-2的表達(dá)量在72 h后顯著下調(diào)；中腎中AjGILT-1的表達(dá)量在16 h后顯著下調(diào)，AjGILT-2的表達(dá)量在24 h后顯著下調(diào).從結(jié)果來(lái)看，整體上AjGILT-1和AjGILT-2在鰓中表達(dá)僅有少數(shù)變化，而在頭腎和中腎中整體表達(dá)變化更明顯.這可能是因?yàn)槟I臟是先天性和適應(yīng)性免疫的主要反應(yīng)位點(diǎn)，也是淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞存在的主要組織，活化的淋巴細(xì)胞和直接刺激的巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)γ-干擾素，從而引起GILT基因表達(dá)的上調(diào)；而鰓是非淋巴組織，雖然巨噬細(xì)胞在鰓中也可以被γ-干擾素刺激，但GILT表達(dá)在鰓中變化不明顯，暗示巨噬細(xì)胞在非淋巴組織中可能是參與先天性免疫而非適應(yīng)性免疫[9].

綜上，本研究克隆了AjGILT-1和AjGILT-2兩個(gè)基因及其啟動(dòng)子序列，對(duì)其進(jìn)行了序列和結(jié)構(gòu)分析.qRT-PCR結(jié)果表明AjGILT-1在鰓和腸中表達(dá)量最高，而AjGILT-2在性腺、頭腎和脾臟中表達(dá)量最高.此外，AjGILT-1和AjGILT-2在病毒和細(xì)菌感染后的免疫應(yīng)答中可能有重要作用，這為日本鰻鱺的病害防治提供了一定的理論基礎(chǔ).