囊胚細(xì)胞計(jì)數(shù)法評價(jià)輔助生殖用醫(yī)療器械臨床前安全性

【作 者】韓倩倩，趙軍招，楊昭鵬，史建峰，王迎，連環(huán)，王春仁，金星亮,

1 中國食品藥品檢定研究院，北京市，102629

2 溫州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院育英兒童醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，溫州市，325027

3 悉尼大學(xué)醫(yī)學(xué)院Kolling醫(yī)學(xué)研究院，悉尼再生發(fā)育醫(yī)學(xué)中心，澳大利亞新威爾士州，2065

0 引言

人類體外輔助生殖技術(shù)（Assisted Reproductive Technologies, ART）是治療不孕不育的有效方法。ART產(chǎn)品種類繁多，包括培養(yǎng)液類產(chǎn)品、洗滌液類產(chǎn)品、冷凍復(fù)蘇類產(chǎn)品、穿刺針類產(chǎn)品、導(dǎo)管類產(chǎn)品、培養(yǎng)用耗材類產(chǎn)品等。由于ART的特殊性，這些產(chǎn)品的質(zhì)量檢測不可能直接通過人類胚胎而是通過小鼠為模型來完成[1-4]。常用的小鼠胚胎試驗(yàn)（Mouse Embryo Assay, MEA）的基本指標(biāo)是囊胚的生成率，然后這指標(biāo)已不能完全符合輔助生殖技術(shù)質(zhì)量的要求。例如，小鼠受精卵在低氧濃度（5%）的條件下培養(yǎng)能獲得更好的胚胎發(fā)育力[5]。然而，小鼠受精卵在5%和20%氧濃度的條件下培養(yǎng)96 h都能獲得相同的囊胚形成率，但是所形成的囊胚的細(xì)胞數(shù)及囊胚孵化率不同[5]。MEA的結(jié)果也受到小鼠品系、培養(yǎng)液種類、培養(yǎng)體系等影響[6-8]。理想的MEA應(yīng)該包括檢測所有影響發(fā)育的變量因素，這明顯是不可能達(dá)到的。即便如此，利用動(dòng)物模型的數(shù)據(jù)也不能與人類體內(nèi)胚胎發(fā)育的要求一致。在目前尚未發(fā)現(xiàn)最優(yōu)化檢測ART質(zhì)量的方法之前，MEA仍不失為一種有效的手段。然而，在我們已經(jīng)知道目前MEA缺點(diǎn)的情況下，必須建立一種較敏感而更有效地檢測ART胚胎質(zhì)量的方法。大量研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胚胎細(xì)胞數(shù)及囊胚細(xì)胞系分類計(jì)數(shù)是一種簡單實(shí)用的首選方法[9-12]。該方法的特征是在原有鼠胚試驗(yàn)的基本標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)上，增加了兩個(gè)檢測指標(biāo)，分別為胚胎的細(xì)胞總數(shù)和囊胚期胚胎中內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞的總數(shù)。其方法包括下述步驟：①胚胎的細(xì)胞總數(shù)的檢測方法，比較受精卵體外培養(yǎng)發(fā)育的胚胎與體內(nèi)發(fā)育的同期胚胎內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)；②囊胚期胚胎中內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞的總數(shù)的檢測方法，比較體外培養(yǎng)生成的囊胚和體內(nèi)發(fā)育的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)表達(dá)UTF1和滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)CDX2的細(xì)胞數(shù)，及其兩者分別占囊胚總細(xì)胞數(shù)的比率。

人類ART胚胎質(zhì)量是提高ART成功率的關(guān)鍵，建立以動(dòng)物模型為基礎(chǔ)的ART質(zhì)控體系保證了ART適應(yīng)日益增長的臨床需要和高質(zhì)量新產(chǎn)品的開發(fā)。

1 材料和試劑

1.1 動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物品系：F1雜交CBA/C57小鼠。

超排計(jì)劃：獲取受孕小鼠的1-細(xì)胞受精卵。4～8周齡雌鼠，經(jīng)腹腔注射PMSG（孕馬血清促性腺激素）5 IU/只；48 h后經(jīng)腹腔注射hCG（人絨毛膜促性腺激素）5 IU/只，注射hCG當(dāng)日雌鼠與同品系成熟已證實(shí)生育正常的雄鼠（鼠齡不超過6個(gè)月）合籠過夜。第二天上午8點(diǎn)檢查交配情況，選擇見栓小鼠備用。

1.2 試劑

固定液：由磷酸鹽緩沖液PBS加2 g/100 mL的多聚甲醛（Para dehydrofloride, PFA）組成，pH值為7.4。

胚胎漂洗液：PBS加0.01 μL/100 mL的聚山梨酯（TWEEN-20）。

細(xì)胞膜打孔液：固定液加0.3 μL/100 mL的TWEEN-20和0.2 μL /100 mL的聚乙二醇對-（1, 1, 3, 3-四甲基丁基）-苯基醚（Triton X 100）。

固定染色液：由PBS加PFA 2 g/100 mL 和10 μg/mL的雙苯甲亞胺（bisBenzimide trihydrochloride,Hoechst33342）組成；

制片液：磷酸鹽緩沖液P B S加抗淬滅劑DABCO。

DNA染色液：①磷酸鹽緩沖液PBS加0.1 μg/mL的碘化丙啶 （Prepedium Iodine, PI）；②磷酸鹽緩沖液PBS加10 μg/mL的4', 6-二脒-2-苯基吲哚（DAPI）。

以上試劑均購于Sigma公司。

抗體：UTF1抗體 （Rabbit anti-UTF1 polyclonal IgG）和CDX2抗體（Mouse anti-CDX2 polyclonal IgG）（購于Abcam公司）。二抗為goat anti-rabbit FITC conjugated IgG和goat anti-mouse texas red conjugated IgG（購于Sigma公司）。

2 試驗(yàn)過程和結(jié)果

2.1 體外胚胎培養(yǎng)

1-細(xì)胞鼠胚收集：注射hCG后18～20 h斷頸處死見栓雌鼠，在輸卵管壺腹部收集1-細(xì)胞鼠胚。將收集到的絮狀受精卵團(tuán)放置到透明質(zhì)酸酶（150 μg/mL）中，當(dāng)胚胎周圍的卵丘和顆粒細(xì)胞被消化分離后立即取出。用卵母細(xì)胞緩沖液（購于南京優(yōu)而生物）清洗3次后，挑選出正常形態(tài)的胚胎，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)微滴中，用于1-細(xì)胞鼠胚檢測試驗(yàn)。胚胎在培養(yǎng)液中的濃度為每10 μL液滴中放入10個(gè)胚胎。

胚胎培養(yǎng)：小鼠受精卵移至10～50 μL培養(yǎng)液微滴，上面覆蓋大約2 mm厚的礦物油（Sigma）；37oC恒溫、保濕， 5% CO2的條件下培養(yǎng)；加入胚胎前，培養(yǎng)液必須在孵化箱內(nèi)平衡2～4 h，pH值為7.4；使用目前常用的培養(yǎng)液（KSOM, 購于南京優(yōu)而生物公司）和人類胚胎培養(yǎng)液作為對照。鼠胚數(shù)為10個(gè)，以10 μL大小的液體微滴培養(yǎng)的密度為標(biāo)準(zhǔn)[5]。

2.2 囊胚質(zhì)量判斷

每24 h在倒置顯微鏡下記錄胚胎發(fā)育動(dòng)態(tài)過程。培養(yǎng)96 h的囊胚形態(tài)觀察：發(fā)育良好的囊胚，囊胚腔充分?jǐn)U張，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)大小適中，滋養(yǎng)層細(xì)胞連接緊密且大小均勻。發(fā)育差的囊胚，囊胚腔小，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)小或無內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，滋養(yǎng)層細(xì)胞稀疏。

（1）囊胚形成率。1-細(xì)胞胚胎體外培養(yǎng)96 h后記錄囊胚數(shù)量，對形成囊胚的受精卵比例進(jìn)行計(jì)算。

（2）囊胚總細(xì)胞數(shù)。檢測利用Hoechst33342可以穿透正常和凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜，對細(xì)胞核染色，發(fā)藍(lán)色熒光的原理。收集的優(yōu)質(zhì)囊胚，在胚胎漂洗液中漂洗3次，將胚胎轉(zhuǎn)移至固定染色液中，轉(zhuǎn)移過程中盡可能攜帶少量的PBS液，避光染色10 min。取抗淬滅劑10 μL滴于載玻片上，將胚胎移到液滴上，液滴四周以凡士林支撐，將蓋玻片輕輕壓到液滴上，與凡士林接觸后適當(dāng)加壓，使囊胚充分延展。用熒光顯微鏡觀察。Hoechst33342染色的細(xì)胞核DNA，可作為小鼠囊胚期胚胎的總細(xì)胞計(jì)數(shù)的有效手段。箭頭所指的是含DNA碎片細(xì)胞核。染色結(jié)果見圖1。UTF1的陽性細(xì)胞，對比度較強(qiáng)的部分（紅色）表示滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)CDX2的陽性細(xì)胞。較淺的部分（藍(lán)色）為Hoechst33342 DNA染色，代表了囊胚的總細(xì)胞數(shù)。利用以上染色方法，成功對內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞細(xì)胞進(jìn)行了染色和區(qū)分。這有助于對囊胚細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和質(zhì)量判斷。

圖1 小鼠囊胚DNA染色Fig.1 The staining of DNA of mouse embyro

（4）試驗(yàn)方法在產(chǎn)品上的驗(yàn)證。使用本染色和技術(shù)方法，在市售的4種培養(yǎng)基上做了驗(yàn)證工作。比較幾種培養(yǎng)基的體外培養(yǎng)的囊胚與體內(nèi)發(fā)育的囊胚，結(jié)果見表1所示。KSOM培養(yǎng)基和KSOM+AA培養(yǎng)基的UTF1陽性的細(xì)胞總數(shù)顯著低于體內(nèi)發(fā)育的囊胚。KSOM培養(yǎng)基的細(xì)胞數(shù)顯著低于體內(nèi)發(fā)育的囊胚。說明本方法對于評價(jià)囊胚質(zhì)量的可靠性好。

（3）囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及滋養(yǎng)層細(xì)胞的雙熒光染色。根據(jù)囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)表達(dá)UTF1和滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)CDX2，這兩個(gè)分子標(biāo)記，進(jìn)行雙熒光染色。體囊胚在胚胎漂洗液內(nèi)漂洗3次；漂洗后移入固定液，在室溫下固定30 min，然后移至細(xì)胞膜打孔液30 min，再以胚胎漂洗液漂洗10 min，重復(fù)3次。將上述處理后的胚胎在室溫下置于體積比為30%的與二級抗體相同源的動(dòng)物血清中3 h以封殺非特異性的抗體結(jié)合位點(diǎn)。在4oC條件下將處理后的胚胎與初級抗體（抗UTF1和CDX2）結(jié)合8～16 h，再以胚胎漂洗液漂洗胚胎10 min，重復(fù)3次；然后在室溫避光條件下與二級抗體結(jié)合1 h；再以胚胎漂洗液漂洗胚胎10 min，重復(fù)3次；根據(jù)二級抗體所聯(lián)結(jié)熒光色譜，將胚胎移至DNA染色液中，在室溫避光條件下孵化10 min；DNA染色液的熒光色素必須與二級抗體所聯(lián)結(jié)熒光色素不同，以區(qū)分DNA和被標(biāo)記的抗原UTF1或CDX2；將孵化后的胚胎移至制片液，制片；置于室溫避光條件下10 min；采用熒光顯微鏡技術(shù)檢查胚胎表達(dá)UTF1和CDX2的細(xì)胞總數(shù)和DNA染色的總細(xì)胞數(shù)（圖2）。高亮部分（綠色）熒光表示內(nèi)細(xì)胞團(tuán)

圖2 囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及滋養(yǎng)層細(xì)胞的雙熒光染色Fig.2 The double fl uorescent staining of inner cell and trophoblastic cell

（5）優(yōu)質(zhì)囊胚的標(biāo)準(zhǔn)研究。分析合籠96 h體內(nèi)發(fā)育的囊胚的細(xì)胞數(shù)＞50個(gè)，ICM細(xì)胞＞ 14個(gè)以上，其所占細(xì)胞總數(shù)的比例是30%左右，碎裂核較少（表1）。比較胚胎培養(yǎng)液對小鼠受精卵96 h胚胎發(fā)育的影響（表1），發(fā)現(xiàn)簡單培養(yǎng)液（KSOM）和幾個(gè)臨床常用的ART培養(yǎng)液都可以產(chǎn)生80%以上的囊胚形成率，但囊胚計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)簡單培養(yǎng)液中形成的囊胚的細(xì)胞總數(shù)較低（＜50個(gè)），碎片細(xì)胞核多（＞3個(gè)）。雙熒光染色進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)ICM細(xì)胞數(shù)少（＜8個(gè)），ICM占囊胚細(xì)胞總數(shù)不到20%。KSOM培養(yǎng)液中加氨基酸后，胚胎發(fā)育有所改善細(xì)胞總數(shù)可達(dá)到50個(gè)，但I(xiàn)CM數(shù)不到10個(gè)。當(dāng)受精卵在臨床用的ART培養(yǎng)液所產(chǎn)生的囊胚的細(xì)胞總數(shù)都大于50個(gè)，ICM細(xì)胞及其所占細(xì)胞總數(shù)的比例都明顯增加，碎片細(xì)胞核減少。

表1 幾種培養(yǎng)液對胚胎發(fā)育的影響Tab.1 The in vitro culturing results of four kinds of medium

3 討論

ART主要包括IVF（In Vitro Fertilization，體外受精) 和ICSI-IVF兩種主要技術(shù)。ART是解決不育不孕癥的重要手段，也是人類獲得人類胚胎干細(xì)胞的唯一途徑。通過選擇優(yōu)質(zhì)胚胎移植，植入前基因診斷（Preimplantation Genetic Diagnosis, PGD）和植入前胚胎篩選技術(shù)（Preimaplantation Genetic Screen,PGS），是實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育的重要技術(shù)手段。在ART的過程中需要一系列的試劑類和器具類醫(yī)療器械來實(shí)現(xiàn)配子的獲得、受精和發(fā)育等過程。液體類醫(yī)療器械如取卵液、精子洗滌液、體外受精液、卵裂液、囊胚培養(yǎng)液，用于胚胎保存的胚胎冷凍液、囊胚冷凍液、胚胎解凍液以及用胚胎活檢液等一系列產(chǎn)品。器具類醫(yī)療器械產(chǎn)品包括取卵針、囊胚培養(yǎng)用平板、取卵管等。近年來國內(nèi)已有數(shù)十種相關(guān)產(chǎn)品出現(xiàn)，隨著使用人群的不斷擴(kuò)大，產(chǎn)品的安全性問題會(huì)進(jìn)一步加大。因此，制定相應(yīng)的安全性評價(jià)檢測方法已迫在眉睫。鼠胚試驗(yàn)是在體外觀察受精卵發(fā)育程序及狀態(tài)的一個(gè)常用試驗(yàn)方法，可以用來評價(jià)體外生殖用醫(yī)療器械對受精卵及受精卵發(fā)育的毒性影響。但是在鼠胚試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中，僅僅依靠囊胚形成率來評判產(chǎn)品合格與否是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。囊胚形成率僅依靠形態(tài)學(xué)的觀察是不夠的，囊胚的外形與囊胚的質(zhì)量并不相關(guān)，一個(gè)質(zhì)量好的囊胚僅靠外形是無法判斷其質(zhì)量的。

本研究建立了對囊胚內(nèi)外細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行鑒定和計(jì)數(shù)的方法，并且建立了評價(jià)試驗(yàn)體系和評價(jià)指標(biāo)。根據(jù)體內(nèi)發(fā)育囊胚分析，建議細(xì)胞總數(shù)至少50個(gè)以上，而細(xì)胞核碎裂等異常不應(yīng)大于3%，UTF1陽性的ICM細(xì)胞數(shù)14個(gè)以上，才符合優(yōu)質(zhì)囊胚的要求。液體類醫(yī)療器械主要是培養(yǎng)液。器具類醫(yī)療器械也是要通過其浸提液來完成質(zhì)量檢測。本研究通過分析簡單培養(yǎng)液和人類ART用的幾種培養(yǎng)液，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的囊胚率80%的標(biāo)準(zhǔn)較低，KSOM培養(yǎng)的囊胚細(xì)胞總數(shù)明顯低于標(biāo)準(zhǔn)，加氨基酸后的細(xì)胞總數(shù)增加了，但I(xiàn)CM細(xì)胞數(shù)還是較低，而臨床用的Vitrolife（分程培養(yǎng)液）和Sage的全程培養(yǎng)液已經(jīng)達(dá)到了基本要求。因此囊胚細(xì)胞總數(shù)結(jié)合內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)及其占細(xì)胞總數(shù)的比例才可以比較出不同培養(yǎng)液的優(yōu)缺點(diǎn)。這個(gè)方法可用于輔助生殖用醫(yī)療器械的上市前質(zhì)量評價(jià)和生產(chǎn)質(zhì)控中。因?yàn)閷τ谳o助生殖用醫(yī)療器械產(chǎn)品，出廠前必須通過鼠胚試驗(yàn)來檢測產(chǎn)品的安全性，所以一個(gè)全面的鼠胚試驗(yàn)方法是非常重要的。

必須指出的是，鼠胚試驗(yàn)受到多種因素的影響[13]。其中小鼠品系和培養(yǎng)的氧濃度是最敏感的兩大因素。目前通常用F1小鼠進(jìn)行MEA，這明顯降低了其敏感性，而氧濃度等因素都沒有完全優(yōu)化，因此目前的鼠胚試驗(yàn)處于次優(yōu)化條件下。除了對鼠胚試驗(yàn)方法進(jìn)行完善，也需要建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的陰性對照。本文研究者將繼續(xù)開發(fā)用于鼠胚試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基和陰性對照標(biāo)準(zhǔn)品及陽性對照標(biāo)準(zhǔn)品。