磷脂酶D缺失對(duì)小鼠抗煙曲霉感染過(guò)程的影響研究

劉曉宇 張常建 胡穎嵩 陳芳艷 韓黎

(1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院，北京 100039；2.解放軍疾病預(yù)防控制所 醫(yī)院感染監(jiān)控中心，北京 100071)

煙曲霉 (Aspergillusfumigatus)是一種腐生性條件致病真菌，可產(chǎn)生大量的孢子，漂浮于空氣中，一般情況下對(duì)正常人不致病，但容易感染免疫力低下群體，如接受器官移植的患者、化療放療的癌癥患者、HIV患者、中性粒細(xì)胞減少癥患者及長(zhǎng)期使用激素的患者等，感染后會(huì)發(fā)展為曲霉腫、支氣管肺曲霉病及侵襲性肺曲霉病 (invasive pulmonary aspergillus,IPA)等多種肺部疾病[1]。侵襲性肺曲霉病是一種嚴(yán)重危及生命的肺部感染疾病，病死率極高，未治療患者可達(dá)90%以上、經(jīng)治療患者有50%～70%，研究煙曲霉的致病機(jī)制及機(jī)體對(duì)煙曲霉的清除過(guò)程非常重要[2]。

磷脂酶D (Phospholipase D,PLD)是一種普遍存在的磷脂酶類(lèi)，主要作用是水解磷脂酰膽堿 (Phosphatidylcholine,PC)3位末端的酯鍵產(chǎn)生膽堿和一種重要的第二信使分子-磷脂酸 (Phosphatidic acid,PA)。在哺乳動(dòng)物中發(fā)揮主要作用的PLD有兩種亞型，PLD1和PLD2[3]。近期很多研究發(fā)現(xiàn)，由PLD催化產(chǎn)生的PA參與多種細(xì)胞過(guò)程，如細(xì)胞骨架重排、膜泡運(yùn)輸、胞吞胞吐作用、細(xì)胞自噬等[4]，而且癌癥、炎癥性疾病及微生物感染等疾病患者細(xì)胞中都能發(fā)現(xiàn)PLD的異常表達(dá)及活性改變[5]。磷脂酶D對(duì)巨噬細(xì)胞的吞噬能力非常重要，此領(lǐng)域已有很多研究[6-9]，如文獻(xiàn)報(bào)道，由于PLD缺陷的巨噬細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架重排受阻，引起該細(xì)胞對(duì)假結(jié)核病耶爾森菌和IgG包裹顆粒的吞噬能力都顯著下降[6]。至于殺菌作用，有文獻(xiàn)報(bào)道PLD通過(guò)參與第二信使二酰甘油的合成參與巨噬細(xì)胞對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的清除，這是細(xì)胞通過(guò)異體自噬殺滅病原體的途徑[10]。而在真菌感染領(lǐng)域宿主巨噬細(xì)胞PLD功能的研究卻幾乎沒(méi)有。

我們課題組的既往研究發(fā)現(xiàn)，在煙曲霉感染人肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549時(shí)，細(xì)胞PLD的活性顯著升高，PLD抑制劑可以顯著抑制煙曲霉孢子內(nèi)化侵入A549細(xì)胞[11]，說(shuō)明PLD在A549細(xì)胞應(yīng)對(duì)煙曲霉感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用。那么宿主在體內(nèi)應(yīng)對(duì)煙曲霉感染時(shí)，其PLD有什么重要作用？為闡明在機(jī)體免疫功能正常的情況下，PLD缺失對(duì)機(jī)體應(yīng)對(duì)煙曲霉感染的影響，我們利用pld1基因和pld2基因同時(shí)敲除小鼠 (pld1-/-pld2-/-)，在小鼠免疫功能正常的情況下，研究小鼠PLD在清除肺部煙曲霉孢子過(guò)程中所發(fā)揮的作用。因?yàn)樵跈C(jī)體免疫功能正常的情況下，肺泡巨噬細(xì)胞在清除煙曲霉感染時(shí)發(fā)揮主要作用，所以我們選擇巨噬細(xì)胞作為研究對(duì)象。

1 材料與方法

1.1 菌株

煙曲霉B5233菌株，生長(zhǎng)于沙氏培養(yǎng)基 (SDA)，37℃培養(yǎng)箱生長(zhǎng)3～5 d后，用含0.1%吐溫20的磷酸鹽緩沖液 (PBST)收集孢子，40 μm濾器過(guò)濾去除菌絲，然后用PBST洗兩遍后計(jì)數(shù)，4℃保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞

pld敲除小鼠 (pld1-/-pld2-/-)由德國(guó)BernhardNieswandt教授研究組惠贈(zèng)。C57BL/6J野生小鼠，雄性，體質(zhì)量 (20±2) g，SPF級(jí)，購(gòu)自軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院豐臺(tái)動(dòng)物中心，兩種小鼠均飼養(yǎng)于軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院豐臺(tái)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查編號(hào)為IACUC-13-2016-002。小鼠BMDM細(xì)胞是分離的小鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (M-CSF)誘導(dǎo)分化的成熟巨噬細(xì)胞。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

小鼠肺部真菌負(fù)荷檢測(cè)pld1-/-pld2-/-小鼠和野生小鼠各取30只，異氟烷麻醉，通過(guò)鼻滴方式感染，劑量為5×106CFU/只。感染后6 h、24 h、72 h及7 d分別取6只小鼠解剖，取整個(gè)肺組織，稱(chēng)重，加入適量PBS，用勻漿器勻漿，涂布于SDA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱孵育18～20 h后取出計(jì)數(shù)并計(jì)算真菌負(fù)荷。

小鼠支氣管肺泡灌洗液 (BALF)收集及其細(xì)胞收集和迪夫快速染色 感染前和感染后6 h時(shí)pld1-/-pld2-/-小鼠和野生小鼠各取6只，腹腔注射150 μL 25%的烏來(lái)糖麻醉，將小鼠仰臥固定，75%酒精擦拭消毒頸部及胸部，剪開(kāi)頸部皮膚及肌肉，暴露氣管，抽取支氣管肺泡灌洗液，每次緩慢注入1 mL無(wú)菌PBS，重復(fù)3次，抽回的液體各放在1個(gè)1.5 mL無(wú)菌EP管中，2 500 r/min離心10 min，收集上清，用于炎癥因子檢測(cè)；細(xì)胞沉淀用無(wú)菌PBS重懸，2 500 r/min離心10 min，去除上清，RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用迪夫快速染色試劑盒 (Diff-Quik Stain)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。

小鼠骨髓細(xì)胞分離和誘導(dǎo)分化pld1-/-pld2-/-小鼠和野生小鼠各取1只，麻醉后斷頸法處死，浸入75%乙醇中1～2 min。在超凈工作臺(tái)中分離小鼠的股骨和脛骨，放入裝有RPMI 1640培養(yǎng)基的小皿中，用1 mL注射器吸取培養(yǎng)基，將針頭尖插入股骨和脛骨中，沖出骨髓細(xì)胞。用40 μm細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，去除碎片。將過(guò)濾后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，4℃，500 g，離心8 min，沉淀即是骨髓細(xì)胞。用RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，3～4 mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞計(jì)數(shù)。

用含50 ng/mL M-CSF刺激因子和10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)骨髓細(xì)胞，按照2×105個(gè)細(xì)胞每毫升鋪于96孔板，每孔100 μL。在培養(yǎng)的第2天加入50 μL新鮮含刺激因子和血清的1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，第4天小心去除懸浮的細(xì)胞和培養(yǎng)基，重新加入含50 ng/mL M-CSF的新鮮10% FBS 1640培養(yǎng)基100 μL。在培養(yǎng)的6～8 d得到最大量的BMDM細(xì)胞。

制霉菌素法檢測(cè)BMDM細(xì)胞吞噬率 按上述方法接種細(xì)胞，pld1-/-pld2-/-小鼠和野生小鼠各接種3組，每組3孔。實(shí)驗(yàn)前1天將BMDM細(xì)胞培養(yǎng)上清換成含1%FBS的1640培養(yǎng)基，撤走M(jìn)-CSF，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后吸走培養(yǎng)基，換上新鮮的不含血清的1640培養(yǎng)基，按感染比10∶1加入煙曲霉B5233休眠孢子，第1組感染30 min、第2組感染60 min、第3組感染120 min，吸走上清，PBS洗2～3遍，加入含25 μg/mL制霉菌素的1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h，殺死未被吞噬的煙曲霉孢子，棄上清，PBS洗2～3遍，加入100 μL 0.25%的TritonX-100裂解細(xì)胞15 min，用槍頭將細(xì)胞刮下，吹打混勻后取40 μL加入360 μL PBS中混勻，再稀釋10倍，取90 μL涂布再SDA平板上，37℃培養(yǎng)箱孵育24 h后取出計(jì)數(shù)并計(jì)算吞噬率，計(jì)算方法[(每個(gè)板的菌落數(shù)÷0.9)×稀釋倍數(shù)]÷加入孢子數(shù)×100。

小鼠BMDM細(xì)胞殺菌能力檢測(cè) 按上述方法接種細(xì)胞，pld1-/-pld2-/-小鼠和野生小鼠各接種4組，每組3孔。實(shí)驗(yàn)前操作同上，然后按感染比10∶1加入煙曲霉B5233休眠孢子，均感染1 h，棄上清，用PBS洗滌2次，第1組直接裂解細(xì)胞涂板，方法同上，其余各組均加上新鮮的1640培養(yǎng)基，第2組繼續(xù)培養(yǎng)4 h后裂解涂板，第3組繼續(xù)培養(yǎng)6 h后裂解涂板，第四組繼續(xù)培養(yǎng)8 h后裂解涂板。37℃培養(yǎng)箱孵育24 h后計(jì)數(shù)計(jì)算殺菌效率，計(jì)算方法 (第1組菌落數(shù)-第2組、第3組或第4組的菌落數(shù))÷第1組菌落數(shù)。

小鼠肺泡灌洗液炎癥因子含量檢測(cè) 采用eBioscience公司的多因子檢測(cè)試劑盒對(duì)BALF中的炎癥因子進(jìn)行檢測(cè)。

統(tǒng)計(jì)分析 每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，所有計(jì)數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料間的比較采用one-way ANOVA分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 pld1-/-pld2-/-小鼠清除肺組織中煙曲霉孢子的能力下降

免疫功能正常的情況下，感染相同劑量的煙曲霉孢子，隨著感染后時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種小鼠肺組織中煙曲霉負(fù)荷都逐漸下降，但pld1-/-pld2-/-小鼠肺組織真菌負(fù)荷始終高于野生小鼠；盡管兩種小鼠都能在感染后1周內(nèi)完全清除肺組織的煙曲霉孢子，但是野生小鼠在感染后第3天肺組織中煙曲霉負(fù)荷幾乎下降到0，而pld1-/-pld2-/-小鼠需要更長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)清除 (見(jiàn)圖1a)，說(shuō)明pld1-/-pld2-/-小鼠清除煙曲霉感染的能力較弱。另外，迪夫快速染色結(jié)果顯示，感染前和感染后6 h，支氣管肺泡灌洗液中基本都是巨噬細(xì)胞，而感染后6 h，pld1-/-pld2-/-小鼠支氣管肺泡灌洗液中可見(jiàn)大量的游離的及被巨噬細(xì)胞吞噬的煙曲霉孢子，孢子量顯著高于野生小鼠組 (見(jiàn)圖1b～c)，說(shuō)明pld1-/-pld2-/-小鼠肺泡灌洗液中巨噬細(xì)胞的殺菌能力可能減弱。

2.2 pld1-/-pld2-/-小鼠BMDM細(xì)胞吞噬和殺滅煙曲霉孢子的能力降低

為了進(jìn)一步證明pld1-/-pld2-/-小鼠巨噬細(xì)胞的殺菌能力降低，我們分離了小鼠骨髓細(xì)胞，將其誘導(dǎo)分化為成熟的巨噬細(xì)胞 (BMDM)進(jìn)行體外巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)和殺菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種巨噬細(xì)胞吞噬煙曲霉孢子的量均逐漸顯著升高，但是pld1-/-pld2-/-小鼠BMDM細(xì)胞吞噬孢子的數(shù)量始終低于野生小鼠BMDM細(xì)胞組 (見(jiàn)圖2a)；隨著殺菌時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種巨噬細(xì)胞殺滅孢子的數(shù)量也逐漸增加，但是當(dāng)殺菌時(shí)間≥6 h時(shí)，pld1-/-pld2-/-小鼠BMDM細(xì)胞殺滅孢子的數(shù)量顯著低于野生小鼠BMDM組 (見(jiàn)圖2b)。結(jié)果表明，pld1-/-pld2-/-小鼠BMDM細(xì)胞的吞噬能力和殺菌能力均顯著低于野生小鼠 (*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。

2.3 pld1-/-pld2-/-小鼠應(yīng)對(duì)煙曲霉孢子刺激過(guò)程中分泌更多的炎癥因子

為了評(píng)估感染煙曲霉孢子后pld1-/-pld2-/-小鼠支氣管肺泡灌洗液 (BALF)中的炎癥因子分泌情況，我們分別在感染前和感染后6、24、72 h和7 d獲取BALF進(jìn)行多種炎癥因子檢測(cè)，結(jié)果顯示隨著感染后時(shí)間的延長(zhǎng)，炎癥因子IL-6、GRO-α及TNF-α含量的變化趨勢(shì)均為先升高后下降，感染后第7天時(shí)都已經(jīng)恢復(fù)至正常水平；檢測(cè)的幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，6 h炎癥因子含量最高；值得注意的時(shí)，感染后6 hpld1-/-pld2-/-小鼠BALF中這些炎癥因子的含量均顯著高于野生小鼠 (*P<0.05，見(jiàn)圖3)。說(shuō)明pld1-/-pld2-/-小鼠應(yīng)對(duì)煙曲霉孢子刺激過(guò)程中可能需要分泌更多的炎癥因子來(lái)參與殺滅孢子過(guò)程。

3 討 論

煙曲霉是一種腐生真菌，其表面的病原相關(guān)分子模式和細(xì)菌表面的大為不同，感染所引起的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)也是不同的。肺泡巨噬細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞是抵抗煙曲霉感染的第1道防線，對(duì)機(jī)體及時(shí)清除煙曲霉孢子尤為重要[12]。正常情況下，機(jī)體肺泡中存在固有巨噬細(xì)胞，當(dāng)孢子被吸入后，肺泡巨噬細(xì)胞可以吞噬并殺滅絕大多數(shù)的煙曲霉孢子。

圖1pld1-/-pld2-/-小鼠清除肺部煙曲霉孢子能力下降。a.小鼠肺組織煙曲霉負(fù)荷；b.小鼠感染煙曲霉6 h后，收集BALF中的細(xì)胞和孢子，迪夫試劑快速染色，鏡下觀察 (bar=25 μm)，圖中紅色箭頭指的是煙曲霉孢子；c.對(duì)b圖視野中孢子數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì) (每組統(tǒng)計(jì)20個(gè)視野)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 圖2pld1-/-pld2-/-小鼠BMDM細(xì)胞吞噬和殺滅煙曲霉孢子的能力下降。a.吞噬實(shí)驗(yàn)，圖中箭頭表示隨著吞噬時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種小鼠對(duì)煙曲霉孢子的吞噬率顯著上升；b.殺菌實(shí)驗(yàn) (煙曲霉孢子：BMDM=10∶1) 圖3 感染后BALF中炎癥因子濃度 (*P<0.05)

Fig.1 PulmonaryA.fumigatusspores eliminating inpld1-/-pld2-/-mice was lower than that in wild mice. a. Fungal burdens in mice lung tissue; b. Diff-Quik Stain results of spores in BALF of mice infected withAspergillusfumigatusfor 6 hours (the red arrow pointed); c. Spore counting of Fig.1b (20 fields were counted each group) Fig.2 BMDM cells ofpld1-/-pld2-/-mice showed decreased ability to phagocyte and killAspergillusfumigatusconidia. a. Phagocytosis: the phagocytosis rate ofAspergillusfumigatusin the BMDM cells increased significantly with the prolongation of the phagocytosis time; b. Fungicidal experiment Fig.3 Expression of cytokines in BALF of mice

近幾年已有研究報(bào)道，巨噬細(xì)胞殺滅煙曲霉的機(jī)制不同于經(jīng)典的吞噬作用和異體自噬作用，而是一種非典型的自噬通路-LC3相關(guān)的吞噬作用 (LC3-associated phagocytosis,LAP)[13-14]。我們發(fā)現(xiàn)，pld1-/-pld2-/-小鼠巨噬細(xì)胞吞噬和殺滅煙曲霉孢子的能力均減弱，說(shuō)明PLD可能參與LAP過(guò)程，也是我們今后的研究方向，研究清楚PLD如何參與LAP殺菌過(guò)程，對(duì)正確理解巨噬細(xì)胞殺滅煙曲霉的機(jī)制非常重要。

免疫功能正常的宿主在吸入煙曲霉孢子后會(huì)引起輕度而短暫的炎癥反應(yīng)以清除孢子，而我們發(fā)現(xiàn)，pld1基因和pld2基因同時(shí)缺失后，由于巨噬細(xì)胞吞噬殺菌能力以及其他免疫功能的下降，小鼠支氣管BALF中的孢子量和整個(gè)肺組織中的煙曲霉真菌負(fù)荷遠(yuǎn)大于野生組。在這種情況下，機(jī)體可通過(guò)分泌更多的炎癥因子以募集其他的免疫細(xì)胞來(lái)清除感染，通過(guò)多因子檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)感染后6 h，pld1-/-pld2-/-小鼠BALF中促炎細(xì)胞因子GRO-α、TNF-α和IL-6的含量顯著高于野生小鼠。GRO-α是一種趨化因子，可以募集中性粒細(xì)胞至肺組織感染部位[15]。TNF-α可以提高中性粒細(xì)胞的吞噬能力，而IL-6能刺激參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞增值和分化并提高其功能，這都有助于增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。但是眾所周知，過(guò)度的炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體是不利的，TNF-α和IL-6同時(shí)也是促炎因子，參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生，在機(jī)體發(fā)生炎癥損傷時(shí)總是含量較高，如果PLD缺陷的個(gè)體受到煙曲霉的持續(xù)感染，可能會(huì)引起機(jī)體急性炎癥損傷[16-19]。

我們的研究說(shuō)明PLD缺失后，肺泡巨噬細(xì)胞吞噬和殺滅煙曲霉孢子的能力的下降可能是影響機(jī)體抗煙曲霉感染進(jìn)程的原因之一，同時(shí)，PLD缺失后高負(fù)荷的煙曲霉可能會(huì)引起肺部的炎癥損傷。本課題還會(huì)進(jìn)一步評(píng)估PLD缺陷對(duì)其他免疫細(xì)胞募集的影響以及對(duì)小鼠肺泡上皮屏障功能的影響，同時(shí)，也會(huì)展開(kāi)PLD對(duì)免疫缺陷機(jī)體應(yīng)對(duì)煙曲霉感染的影響研究。在體外我們會(huì)繼續(xù)研究PLD如何參與巨噬細(xì)胞的殺菌能力，還會(huì)基于之前的發(fā)現(xiàn)研究PLD在上皮細(xì)胞應(yīng)對(duì)煙曲霉感染中的作用，為煙曲霉的感染機(jī)制及機(jī)體的抗感染機(jī)制提供有力依據(jù)。