蔓荊子黃素對小鼠單核巨噬細(xì)胞增殖和凋亡的影響

楊遠(yuǎn)超，何芳，劉學(xué)偉，溫彬宇，閆妍，唐旭，高俊峰，王新祥

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078）

蔓荊子為馬鞭草科植物單葉蔓荊或蔓荊的干燥成熟果實(shí)，在我國最早的藥學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品，記載有“主筋骨間寒熱，濕痹拘攣，明目，堅(jiān)齒，利九竅，去白蟲”。蔓荊子為臨床常用中藥，其性寒、味辛苦，入肝、胃、膀胱經(jīng)，具有疏散風(fēng)熱、清利頭目的功效，用于治療風(fēng)熱感冒頭痛、齒齦腫痛、目赤多淚、目暗不明及頭暈?zāi)垦５劝Y[1]。有研究表明，蔓荊子具有鎮(zhèn)痛、抗炎、降壓、抗菌、祛痰和抗腫瘤等作用[2-3]。主要成分含揮發(fā)油、微量生物堿、維生素A、蔓荊子黃素、蔓荊子堿及γ-氨基丁酸等[4-5]。其中，蔓荊子黃素被認(rèn)為是主要有效成分之一，藥典規(guī)定不得低于0.030%要求，一般含有量在0.027%～0.139%之間[6]。

蔓荊子黃素（Vitexicarpin），又稱為紫花牡荊素（Casticin），屬于多甲氧基黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗氧化、抑制炎癥反應(yīng)和免疫抑制等[7]多方面的藥理作用。近年來在抗腫瘤作用方面，有研究顯示蔓荊子黃素對乳腺癌、肺癌、宮頸癌、肝癌及胃癌等[8-12]多種腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的增殖抑制活性，有可能作為植物來源的抗腫瘤候選藥物。另外，其免疫調(diào)節(jié)作用也較早受到關(guān)注。YOU等[13]最早報(bào)道，蔓荊子黃素能夠有效抑制小鼠T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增殖。MESAIK等[14]研究發(fā)現(xiàn)，蔓荊子黃素能夠?qū)魏思?xì)胞的氧化裂解產(chǎn)生顯著的抑制作用，對嗜中性粒細(xì)胞的趨化性和植物凝血素刺激的T淋巴細(xì)胞也顯示抑制作用。林珊等[15]采用乙酸誘導(dǎo)的小鼠腹膜毛細(xì)血管通透性增加的模型，發(fā)現(xiàn)蔓荊子黃素具有明顯的體內(nèi)抗炎作用。王紅英等[16]研究發(fā)現(xiàn)，紫花牡荊素可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子改善佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠足跖腫脹度。上述研究顯示，蔓荊子黃素治療炎癥或免疫調(diào)節(jié)性疾病可能有良好應(yīng)用前景，然而目前為止，對屬于免疫細(xì)胞的單核/巨噬細(xì)胞作用的研究未見任何報(bào)道。本研究通過對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活性以及對單核巨噬細(xì)胞RAW264.7的細(xì)胞增殖、凋亡的研究，來揭示蔓荊子黃素對免疫的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥品與試劑 ICR小鼠2只，雄性，8～10周齡，體重30～40 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；RAW264.7小鼠單核巨噬細(xì)胞株由北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院郝鈺教授饋贈(zèng)，DMEM培養(yǎng)基為Hy Clone公司產(chǎn)品，胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、青鏈霉素混合液、胰蛋白酶消化液（0.25%trypsin-EDTA）均為Gibco公司產(chǎn)品，蔓荊子黃素（vitexicarpin）購自上海源葉生物科技有限公司，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）、無水乙醇（ethanol）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）購自 Solarbio公司，CCK-8（cell counting kit-8）試劑盒購自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司，活性氧（reactive oxygen species,ROS）檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，碘化丙啶（propidium iodide, PI）、溴化乙錠（ethidium bromide, EB）為Sigma公司產(chǎn)品，吖啶橙（acridine orange, AO）購自欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司，JC-1購自Fluka公司，0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液購自Solarbio公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 二氧化碳CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo公司），移液器（德國Eppendorf公司）（型號為2.5、20.0、200.0及1 000.0 μl），超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司），倒置熒光相差顯微鏡（日本Olympus公司IX71），酶聯(lián)免疫檢測儀（Bio Tek公司ELX800），全功能酶標(biāo)儀（Bio Tek公司 Synergy H1），高速低溫離心機(jī)（德國Eppendorf公司，Centrifuge 5424R），低速離心機(jī)（北京白洋淀醫(yī)療器械有限公司，320C），流式細(xì)胞儀（美國BD公司FACSCanto Ⅱ）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外分離與培養(yǎng) 隨機(jī)選取2只ICR小鼠，腹腔注射不含血清培養(yǎng)基5 ml，輕柔小鼠腹部2～3 min，使液體在腹腔內(nèi)充分流動(dòng)，靜置5～7 min后將小鼠頸椎脫臼處死，置于解剖板上，無菌條件下打開腹腔，用眼科鑷提起下腹皮膚，剪1個(gè)小口，并沿腹中線剪開3～5 cm的腹部皮膚，充分暴露腹膜，剪開腹部皮膚后在肌肉層剪1個(gè)小口，用吸管吸取腹腔灌洗液，并重復(fù)灌洗1次。

將2次收集的腹腔灌洗液轉(zhuǎn)至15 ml離心管，1 000 r/min離心5 min，去上清，用PBS洗滌2遍。加入DMEM完全培養(yǎng)基（含10% FBS、0.1%青鏈霉素溶液），用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，顯微鏡下（×100）計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞。用DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)至2×106個(gè)/ml，接種于培養(yǎng)瓶及96孔板，放入37℃、5% CO2、相對濕度≥95%的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，使巨噬細(xì)胞充分貼壁。孵育4 h后，去上清，用DMEM培養(yǎng)基洗滌1、2次，去除非黏附的其他細(xì)胞，獲得的貼壁細(xì)胞即為單層的巨噬細(xì)胞，放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。另取巨噬細(xì)胞懸液0.9 ml于1.5 ml離心管中，加入0.1 ml 0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液（終濃度為0.04%），混勻，靜置2～3 min后，取1滴染色的細(xì)胞懸液滴加入計(jì)數(shù)板中，置于顯微鏡下觀察，分別計(jì)數(shù)死細(xì)胞、活細(xì)胞，計(jì)算活細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分率，顯示巨噬細(xì)胞的成活率達(dá)95%以上。

1.2.2 RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞為小鼠源巨噬細(xì)胞，培養(yǎng)在含10% FBS、100 u/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、含5%CO2、相對濕度≥95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3天傳代1次。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞活性檢測 按照CCK-8試劑盒說明書提供的方法，分別測定蔓荊子黃素對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞及RAW264.7細(xì)胞的增殖抑制作用。

將小鼠原代分離的腹腔巨噬細(xì)胞，以細(xì)胞數(shù)1×105個(gè)/ml接種于96孔板，每孔100 μl，置于37℃、含5%CO2、相對濕度≥95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用含有不同濃度蔓荊子黃素（0、1、5、10及50 μmol/L）的完全培養(yǎng)基作用24、48和72 h，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白組（只含有等量培養(yǎng)基）和對照組（含同數(shù)量細(xì)胞和等量培養(yǎng)基），每孔加入10 μl CCK-8溶液，37℃培養(yǎng)4 h后，使用EXL-800酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm波長測定細(xì)胞樣品的光密度（optical density,OD）。

取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞，以細(xì)胞數(shù)1×105個(gè)/ml接種于96孔板，100 μl/孔，置于37℃、含5%CO2、相對濕度≥95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將蔓荊子黃素配制的溶液（DMSO濃度＜0.15%），分別設(shè)定0.0、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0及10.0 μmol/L不同濃度，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白組（只含有等量培養(yǎng)基）和對照組（含同數(shù)量細(xì)胞和等量培養(yǎng)基），加藥后分別將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h，每孔加入10 μl CCK-8溶液，37℃培養(yǎng)2 h，使用EXL-800酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm波長測定細(xì)胞樣品的OD值。

按如下公式計(jì)算細(xì)胞活性：細(xì)胞活性（%）=[OD（加藥）-OD（空白）]/[OD（對照）-OD（空白）]×100%，計(jì)算細(xì)胞存活率；數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)算抑制細(xì)胞生長達(dá)50%的各藥物濃度，即半數(shù)抑制濃度，以IC50值（50% inhibitory concentration）表示。相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍，計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。繪制時(shí)間-存活率折線圖。

1.2.4 RAW264.7細(xì)胞核AO/EB雙染觀察細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞，以細(xì)胞數(shù)1×105個(gè)/ml接種于96孔板，每孔100 μl，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待其貼壁后，用含有不同濃度蔓荊子黃素（0.0、0.1、1.0、5.0及10.0 μmol/L）的完全培養(yǎng)基作用細(xì)胞48 h，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，依次加入AO染色液（終濃度為5 μg/ml）及EB染色液（終濃度為10 μg/ml），4℃避光孵育20 min后，用PBS洗滌2次。使用藍(lán)光熒光激發(fā)的濾光片，在倒置熒光相差顯微鏡下觀察細(xì)胞核的染色情況并拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 RAW264.7細(xì)胞凋亡率檢測 取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞，以細(xì)胞數(shù)2.5×105個(gè)/ml接種于6孔板，每孔2 ml，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)待貼壁，用含有不同濃度蔓荊子黃素（0.0、0.1、1.0、5.0及10.0 μmol/L）的完全培養(yǎng)基作用細(xì)胞48 h后，胰酶消化后收集細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，去上清液，預(yù)冷PBS洗2次，制成單細(xì)胞懸液，離心去PBS，加入冰預(yù)冷的70%的乙醇固定，4℃放置8 h以上，取出固定的樣品，2 000 r/min離心10 min，去上清液，加入1 ml預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，離心后去上清收集細(xì)胞；加入PI染液（終濃度為150 μg/ml）染色，4℃避光染色30 min，400目篩網(wǎng)過濾1次，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.6 RAW264.7細(xì)胞活性氧含量檢測 取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞，以細(xì)胞數(shù)1×106個(gè)/ml接種于96孔板，每孔100 μl，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)待貼壁。然后用含有不同濃度蔓荊子黃素（0.0、0.1、1.0、5.0及10.0 μmol/L）的完全培養(yǎng)基作用細(xì)胞2 h，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置空白對照組、陽性對照組。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入100 μl用無血清培養(yǎng)液稀釋的2',7'-二氯熒光素二乙酸酯（終濃度為10 μmol/L），陽性對照組加入Rosup（終濃度為10 μmol/L），37℃孵育20 min后去培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基洗滌3次。按照活性氧（ROS）檢測試劑盒說明書提供的方法，在倒置熒光相差顯微鏡下觀察并拍照，使用全功能酶標(biāo)儀檢測熒光值，激發(fā)波長設(shè)置為488 nm，發(fā)射波長設(shè)置為525 nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.7 RAW264.7細(xì)胞線粒體膜電位的檢測 取對數(shù)生長期RAW264.7細(xì)胞，以細(xì)胞數(shù)1×105個(gè)/ml接種于96孔板，每孔100 μl，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，用含有不同濃度蔓荊子黃素（0.0、0.1、1.0、5.0及10.0 μmol/L）的完全培養(yǎng)基分別作用細(xì)胞24、48和72 h，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入100 μl JC-1染色液（終濃度為5 μg/ml），37℃培養(yǎng)20 min后去培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次。倒置熒光相差顯微鏡下觀察并拍照，全功能酶標(biāo)儀檢測熒光值，檢測JC-1單體時(shí)激發(fā)波長設(shè)置為488 nm，發(fā)射波長設(shè)置為530 nm；檢測JC-1聚合物時(shí)，激發(fā)波長設(shè)置為529 nm，發(fā)射波長設(shè)置為590 nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較使用單因素或重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蔓荊子黃素對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活性的影響

各組經(jīng)藥物作用不同時(shí)間后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞存活率比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間的各組細(xì)胞的存活率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=20.590，P=0.000），②各組細(xì)胞的存活率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.679，P=0.012），50μmol/L蔓荊子黃素劑量組與0.0、1.0、5.0及10.0μmol/L劑量組比較，抑制作用較強(qiáng)，③各組細(xì)胞的存活率變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=23.352，P=0.000）。見表1。

藥物作用24和48 h時(shí)，各濃度蔓荊子黃素對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞未表現(xiàn)出抑制作用；藥物作用至72 h，各濃度的蔓荊子黃素均對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，呈明顯的量效依存性，與0.0 μmol/L組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中，50 μmol/L濃度的抑制作用最強(qiáng)，達(dá)26.4%。

表1 蔓荊子黃素對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活性的影響（n =4，±s）

表1 蔓荊子黃素對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞活性的影響（n =4，±s）

蔓荊子黃素濃度OD值24 h 48 h 72 h 0.0 μmol/L 0.358±0.004 0.381±0.019 0.463±0.006 1.0 μmol/L 0.354±0.003 0.388±0.017 0.430±0.006 5.0 μmol/L 0.367±0.015 0.419±0.033 0.420±0.027 10.0 μmol/L 0.352±0.008 0.389±0.034 0.394±0.019 50.0 μmol/L 0.339±0.017 0.374±0.012 0.341±0.017

2.2 蔓荊子黃素對RAW264.7細(xì)胞活性的影響

各組經(jīng)藥物作用不同時(shí)間后RAW264.7細(xì)胞存活率比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間的各組細(xì)胞的存活率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=37.154，P=0.000）。②各組細(xì)胞的存活率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=296.736，P=0.000），2、5及10 μmol/L蔓荊子黃素劑量組與0.0、0.1、0.5及1.0 μmol/L劑量組比較，抑制作用較強(qiáng)。③各組細(xì)胞的存活率變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=27.738，P=0.000）。見表 2。

藥物作用結(jié)果顯示，與0.0μmol/L組比較，5.0和10.0 μmol/L蔓荊子黃素劑量組在作用24、48和72 h時(shí)，對細(xì)胞的抑制作用均呈現(xiàn)量效依存性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。24、48 和 72h 的 IC50分別為 6.202、2.628及 3.064μmol/L。

表2 蔓荊子黃素對RAW264.7細(xì)胞活性的影響（n =4，±s）

表2 蔓荊子黃素對RAW264.7細(xì)胞活性的影響（n =4，±s）

蔓荊子黃素濃度OD值24 h 48 h 72 h 0.0 μmol/L 0.767±0.061 0.885±0.041 0.864±0.034 0.1 μmol/L 0.782±0.039 0.871±0.038 0.818±0.054 0.5 μmol/L 0.794±0.139 0.865±0.017 0.841±0.109 1.0 μmol/L 0.800±0.035 0.802±0.117 0.799±0.129 2.0 μmol/L 0.655±0.084 0.702±0.050 0.795±0.032 5.0 μmol/L 0.382±0.008 0.095±0.006 0.131±0.028 10.0 μmol/L 0.296±0.018 0.044±0.009 0.024±0.003

2.3 蔓荊子黃素對RAW264.7細(xì)胞核的影響

0.0μmol/L組大部分細(xì)胞大小、形態(tài)較均一，細(xì)胞呈現(xiàn)均勻的綠色熒光，為正常未發(fā)生凋亡的RAW264.7細(xì)胞（見圖1）；RAW264.7細(xì)胞經(jīng)濃度為5.0及10.0 μmol/L的蔓荊子黃素處理48 h后細(xì)胞體積變小，結(jié)構(gòu)模糊，大部分細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)減少、細(xì)胞核染色質(zhì)固縮偏向一邊或碎裂，呈橘黃色或紅色熒光，顯示為凋亡的形態(tài)，并可見細(xì)胞碎片，及少量未發(fā)生凋亡的細(xì)胞和壞死細(xì)胞（見圖1D、E）。

圖1 蔓荊子黃素對RAW264.7細(xì)胞核染色的影響 （48 h，AO/EB雙染×200）

2.4 蔓荊子黃素對RAW264.7細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，隨著蔓荊子黃素濃度增加，RAW264.7細(xì)胞出現(xiàn)不同的二倍體峰（Sub-G1峰、凋亡峰），根據(jù)此峰的面積得出不同凋亡細(xì)胞的百分率，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.929，P=0.014）。0.1及1.0 μmol/L組細(xì)胞的凋亡率與0.0 μmol/L組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。5.0及10.0 μmol/L組細(xì)胞的凋亡率高于0 μmol/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 2、3。

圖2 蔓荊子黃素對RAW264.7細(xì)胞凋亡率的影響（48 h）

圖3 蔓荊子黃素對RAW264.7細(xì)胞凋亡率的影響（n =4，±s）

2.5 蔓荊子黃素對RAW264.7細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響

以0.0 μmol/L組熒光強(qiáng)度值為1（即100%），計(jì)算不同濃度的蔓荊子黃素組、陽性組與0.0 μmol/L組的比率。在藥物處理2 h時(shí)，隨著蔓荊子黃素濃度的增加，RAW264.7細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平逐漸增加。不同組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.190，P=0.024）。0.1和1.0 μmol/L組細(xì)胞中活性氧表達(dá)水平與0.0 μmol/L比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。5及10 μmol/L組細(xì)胞內(nèi)活性氧表達(dá)水平高于0.0 μmol/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4、5。

圖4 蔓荊子黃素對RAW264.7細(xì)胞活性氧水平的影響（n =4，±s）

圖5 蔓荊子黃素對RAW264.7細(xì)胞活性氧的影響 （2 h，DCFH-DA探針，×100）

2.6 蔓荊子黃素對RAW264.7細(xì)胞線粒體內(nèi)膜電位的影響

正常線粒體內(nèi)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物，聚合物發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光（Ex=585 nm，Em=590 nm）；不健康的線粒體由于膜電位的下降或喪失，JC-1只能以單體的形式存在于胞漿中，產(chǎn)生綠色熒光（Ex=514 nm，Em=529 nm）。線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的1個(gè)標(biāo)志性事件。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以檢測到細(xì)胞膜電位的下降，同時(shí)也可以用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)檢測指標(biāo)。通過計(jì)算紅/綠熒光強(qiáng)度的相對比率可以衡量線粒體去極化的比例。

結(jié)果顯示，各組經(jīng)藥物作用不同時(shí)間的細(xì)胞紅/綠熒光強(qiáng)度比較，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間的細(xì)胞紅/綠熒光強(qiáng)度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.131，P=0.007）。②各組細(xì)胞的紅/綠熒光強(qiáng)度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=47.203，P=0.000），0.0 μmol/L蔓荊子黃素組紅色熒光強(qiáng)，綠色熒光弱，紅/綠熒光強(qiáng)度的相對比例較高，說明大部分細(xì)胞的線粒體膜電位比較正常，細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常；5.0 及10.0 μmol/L蔓荊子黃素劑量組紅色熒光減弱，綠色熒光增強(qiáng)，紅/綠熒光強(qiáng)度較低，細(xì)胞線粒體膜電位較低。說明大部分細(xì)胞線粒體膜電位下降，大部分細(xì)胞處于細(xì)胞凋亡早期，相較于0.0 μmol/L組，5.0、10.0 μmol/L組的RAW264.7細(xì)胞凋亡率增加。③各組細(xì)胞的紅/綠熒光強(qiáng)度變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.649，P=0.017）。見圖6和表3。

圖6 蔓荊子黃素對RAW264.7細(xì)胞線粒體膜電位的影響 （48 h，JC-1染色，×200）

表3 蔓荊子黃素對RAW264.7細(xì)胞線粒體膜電位的影響（n =4，±s）

表3 蔓荊子黃素對RAW264.7細(xì)胞線粒體膜電位的影響（n =4，±s）

蔓荊子黃素濃度紅/綠熒光強(qiáng)度的比值24 h 48 h 72 h 0.0 μmol/L 1.851±0.159 2.877±0.246 1.271±0.104 0.1 μmol/L 1.908±0.439 2.852±0.310 1.344±0.186 1.0 μmol/L 1.904±0.105 2.826±0.312 1.136±0.176 5.0 μmol/L 1.120±0.182 1.057±0.185 0.742±0.102 10.0 μmol/L 1.172±0.126 0.756±0.08 0.502±0.064

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，蔓荊子黃素對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞與小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7的細(xì)胞活性都有抑制作用，尤其對具有增殖能力的RAW264.7細(xì)胞活性抑制作用更強(qiáng)，可以促進(jìn)其凋亡，其作用機(jī)制與增加細(xì)胞內(nèi)活性氧水平與降低線粒體膜電位有關(guān)。

巨噬細(xì)胞是一種位于組織內(nèi)的免疫細(xì)胞，源自血單核細(xì)胞。巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞皆為吞噬細(xì)胞，在脊椎動(dòng)物體內(nèi)參與非特異性免疫和特異性免疫。巨噬細(xì)胞能夠?qū)?xì)胞殘片及病原體進(jìn)行吞噬及消化，并通過釋放細(xì)胞因子等激活免疫系統(tǒng)中的其他細(xì)胞，具有免疫防御、免疫監(jiān)視、免疫調(diào)節(jié)及抗原呈遞等多種免疫功能，在特異性和非特異性免疫過程中均發(fā)揮著重要的作用。蔓荊子黃素對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)顯示，藥物作用至72 h，各個(gè)濃度的蔓荊子黃素均對巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，呈量效依存性，其中50.0 μmol/L濃度的抑制作用達(dá)26.4%。另外，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步使用小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行研究。RAW264.7細(xì)胞因其性質(zhì)穩(wěn)定、易于培養(yǎng)等而常用作細(xì)胞因子、炎癥性疾病及免疫疾病等研究的細(xì)胞模型。對RAW264.7細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)顯示，不同濃度的蔓荊子黃素處理RAW264.7細(xì)胞24 h，與0.0 μmol/L組比較，較高濃度（2.0、5.0及10.0 μmol/L）蔓荊子黃素對RAW264.7細(xì)胞活性呈現(xiàn)量效依存的抑制作用，并隨著藥物作用時(shí)間延長，作用明顯增強(qiáng)，但48與72 h無差異；24、48及72 h的IC50分別為6.202、2.628及3.064 μmol/L，72 h的IC50的值＜48 h的IC50值可能是因?yàn)殡S著時(shí)間增長，蔓荊子黃素作用于細(xì)胞的效應(yīng)經(jīng)過高峰值后開始減弱。蔓荊子黃素對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞與RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞活性都有抑制作用，然而抑制濃度有較大差異，與增殖活躍的RAW264.7的IC50為6.2 μmol/L以下比較，對分化終端而沒有增殖能力的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的IC50雖未能確定，但從50.0 μmol/L時(shí)抑制率為26.4 %來看，說明增殖活躍的細(xì)胞對蔓荊子黃素更為敏感。

細(xì)胞凋亡是多種基因調(diào)控、有序的死亡過程，是細(xì)胞在生理或病理?xiàng)l件下的一種主動(dòng)死亡方式，早期以DNA降解為特征，最終細(xì)胞分解成凋亡小體后被巨噬細(xì)胞吞噬降解。實(shí)驗(yàn)顯示蔓荊子黃素能夠抑制單核巨噬細(xì)胞RAW264.7的細(xì)胞活性，與其促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。RAW264.7細(xì)胞經(jīng)過AO/EB雙染后，在熒光顯微鏡下觀察到RAW264.7細(xì)胞經(jīng)濃度為5.0及10.0 μmol/L的蔓荊子黃素處理后，體積變小，結(jié)構(gòu)模糊，大部分細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)減少、細(xì)胞核染色質(zhì)固縮偏向一邊或碎裂，呈橘黃色或紅色熒光，顯示為凋亡的形態(tài)，并可見細(xì)胞碎片。另外，RAW 264.7細(xì)胞經(jīng)PI染色后通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的結(jié)果顯示，蔓荊子黃素劑量依賴地增加RAW264.7細(xì)胞Sub-G1期代表凋亡細(xì)胞的比例。

有研究顯示，活性氧（ROS）可以通過對生物膜與蛋白質(zhì)或DNA的氧化損傷、影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)等來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。由于蔓荊子黃素在化學(xué)構(gòu)造上屬于多甲氧基黃酮類化合物，具有較強(qiáng)的氧化活性，因此實(shí)驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，探討蔓荊子黃素引起RAW264.7細(xì)胞凋亡的機(jī)制。不同濃度的蔓荊子黃素處理RAW264.7細(xì)胞2 h后，熒光顯微鏡觀察隨著藥物濃度的增高，活性氧產(chǎn)生的增強(qiáng)。熒光酶標(biāo)儀檢定量測定活性氧水平結(jié)果顯示，與0.0 μmol/L組比較，隨著藥物濃度的增高，活性氧水平也隨著增加，以較高濃度蔓荊子黃素組（5.0及10.0 μmol/L）的細(xì)胞活性氧水平增加最為顯著。

活性氧等許多凋亡誘導(dǎo)劑引起的各種類型的細(xì)胞凋亡中均出現(xiàn)線粒體去極化、線粒體膜電位改變引起細(xì)胞凋亡[18]。實(shí)驗(yàn)分別用不同濃度的蔓荊子黃素處理RAW264.7細(xì)胞24、48及72 h，使用JC-1染色顯示線粒體膜電位，熒光顯微鏡觀察到隨著藥物濃度的增高，線粒體膜電位逐漸下降，尤以作用48 h下降最為顯著；熒光酶標(biāo)儀定量檢測結(jié)果顯示，高濃度蔓荊子黃素（5.0及10.0 μmol/L）的線粒體膜電位下降最為顯著。細(xì)胞凋亡過程中線粒體去極化作用增強(qiáng)并且線粒體質(zhì)量下降，表明該凋亡過程與線粒體途徑密切相關(guān)。

近年來，在國外的研究報(bào)道中，蔓荊子黃素在抗腫瘤作用方面研究顯示對多種腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞活性抑制與促凋亡作用，通過阻滯細(xì)胞有絲分裂紡錘體形成[19-20]、阻滯細(xì)胞周期[21-24]、激活相關(guān)細(xì)胞凋亡的信號通路[25-26]及影響DNA的表達(dá)等[27-28]途徑，而對正常細(xì)胞未有影響，因此有可能作為植物來源的抗腫瘤候選藥物。在免疫機(jī)能的調(diào)節(jié)方面，本研究顯示，蔓荊子黃素對小鼠單核巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活性抑制與凋亡促進(jìn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合YOU等[13]與MESAIK等[14]報(bào)道的蔓荊子黃素能夠有效抑制小鼠T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖研究，初步揭示蔓荊子黃素可能作為免疫調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用前景，對其作用與機(jī)制的深入研究，可能應(yīng)用于單核與巨噬細(xì)胞增多相關(guān)疾病，如傳染性單核細(xì)胞增多癥、肉芽腫性疾病、肉狀瘤病、壞死性疾病、發(fā)熱、炎癥疾病或免疫失調(diào)性疾病等，并可能為闡明中藥用于發(fā)熱、濕痹等病癥的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)提供支持與幫助。