lncRNA基因At3NC026490啟動子克隆與功能分析

岳少康，謝 鑫，陳 瀅，李緒彥，邊少敏

（吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062）

在真核生物中90%的基因組可以轉(zhuǎn)錄，大部分轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA （ncRNAs），其中長度大于200 nt、無編碼蛋白能力的RNA被稱為長鏈非編碼RNA （long noncoding RNA，lncRNAs）。近年研究表明，lncRNAs在真核生物中種類豐富且分布廣泛，能夠在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)或直接影響蛋白功能［1-3］，因此作為一個“明星分子”開始受到廣泛關(guān)注。根據(jù)文獻(xiàn)檢索結(jié)果，目前NCBI的PubMed數(shù)據(jù)庫中至少收錄了20多個植物物種lncRNA的報道，每個物種中都有大量的lncRNAs得到鑒定。隨著lncRNA功能缺失與獲得突變體的應(yīng)用，人們對其中少量lncRNAs的生物學(xué)功能有了一定認(rèn)識，主要集中在以下方面：調(diào)控植物開花的過程［4-5］，參與植物有性生殖的調(diào)控［6］，在光形態(tài)建成中扮演重要角色［7］，參與根發(fā)育調(diào)控［8］，調(diào)控種子萌發(fā)過程［9］，參與共生固氮根瘤形成的調(diào)控［10］，在植物磷代謝平衡中發(fā)揮重要作用［11］，在次生代謝物質(zhì)合成過程中發(fā)揮重要作用［12］，參與外界脅迫的應(yīng)答調(diào)控［13］。然而相對于動物而言，目前關(guān)于植物lncRNA功能的研究還處于初步階段。

擬南芥是展開科學(xué)研究的模式植物，其相關(guān)研究成果為研究其他植物尤其是雙子葉植物提供了重要的理論參考。目前在擬南芥中發(fā)現(xiàn) 40 000 多個 lncRNAs［14-15］，僅對COOLAIR、COLDAIR、HID1、APOLO、AsDOG1、At4NC069370等少數(shù)幾個lncRNA的功能進(jìn)行了研究，如COOLAIR通過影響FLC的表達(dá)從而調(diào)控植物開花［4-5］；Wang等［7］報道 HID1 通過其靶標(biāo)基因PIF3介導(dǎo)紅光下植物形態(tài)建成的調(diào)控，APOLO通過作用其靶標(biāo)記憶基因PID從而調(diào)控出生根的發(fā)育［8］；Fedak 等［9］研究表明asDOG1能夠抑制種子成熟過程中DOG1基因的表達(dá)，而asDOG1是調(diào)控種子萌發(fā)的重要因子。對于其余大量的lncRNAs，它們是轉(zhuǎn)錄“噪音”還是功能分子？如果是功能分子，它們參與哪些生物學(xué)過程？這些問題都有待于闡釋。

啟動子通常是位于基因上游起始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，是調(diào)控基因表達(dá)的指揮棒，它不僅能夠調(diào)控基因表達(dá)的水平而且決定基因表達(dá)的部位和方式［16-17］。因此研究基因啟動子特性對于揭示基因在植物生長發(fā)育或響應(yīng)脅迫過程中的生物學(xué)功能具有重要意義。At3NC026490是擬南芥中的一個lncRNA，目前尚未見到關(guān)于其功能方面的報道。本研究克隆了At3NCC026490的啟動子，并通過生物信息學(xué)手段對該啟動子的特性進(jìn)行分析，進(jìn)一步通過啟動子驅(qū)動GUS基因表達(dá)的策略對該啟動子的功能進(jìn)行分析，以期為研究At3NC026490的生物學(xué)功能提供重要的信息和研究思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

將Col-1野生型及轉(zhuǎn)基因擬南芥種子在4℃黑暗環(huán)境下春化3 d，播于蛭石與草炭以1∶3比例混合的基質(zhì)中，然后在22℃、16 h/8 h（光照/黑暗）條件下培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 擬南芥基因組DNA提取 采集Col-1野生型擬南芥葉片，液氮速凍后研磨成粉狀，然后利用CTAB法提取基因組DNA。

1.2.2 擬南芥At3NC026490基因啟動子克隆 在TAIR網(wǎng)站（www.arabidopsis.org）中獲取At3NC026490基因上游1 072 bp的DNA序列，并設(shè)計帶有Gateway接頭的引物At3NC026490-Pro-F（ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctCTTATGTTG ACTATGGGCCTGGTTT）和At3NC026490-Pro-R（ggggaccactttgtacaagaaagctgggtTTAGCGGTTGGCA CCAATCATAG）。以擬南芥基因組DNA為模板，利用高保真酶PrimeStar（TaKaRa）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次；72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物根據(jù)天根公司的普通瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒（離心柱型）說明書進(jìn)行回收。

1.2.3 啟動子區(qū)域驅(qū)動的GUS表達(dá)載體構(gòu)建 利用B P反應(yīng)將P C R產(chǎn)物重組到pDONR207載體中，然后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行涂板篩選，挑取陽性單菌落于37℃搖菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并測序。選取序列正確的質(zhì)粒，利用LR反應(yīng)將啟動子序列構(gòu)建到目標(biāo)載體pMDC162中，最后將成功構(gòu)建好的pMDC162-At3NC026490-Pro質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。

1.2.4 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因陽性苗的篩選 利用蘸花侵染法將At3NC026490基因的啟動子轉(zhuǎn)入擬南芥中。T0代種子經(jīng)次氯酸鈉消毒后播種于含有50 μg/mL潮霉素的MS培養(yǎng)基中，生長10 d后，將依然保持綠色的植株轉(zhuǎn)移到土壤中生長；待T1代轉(zhuǎn)基因苗長到30 d后，采集葉片，按照1.2.1方法提取DNA，然后以啟動子序列設(shè)計正向引物、以GUS基因序列設(shè)計反向引物，通過PCR檢測上述利用抗生素篩選到的陽性苗是否存在目的基因，以確定幼苗為陽性轉(zhuǎn)基因植株，繁殖轉(zhuǎn)基因擬南芥直至篩選到T3代純合體。

1.2.5 GUS染色 選取2個At3NC026490啟動子轉(zhuǎn)基因株系，采集蓮座葉、莖生葉、花以及不同發(fā)育時期的果莢與種子（花后4、7、12、17 d），同時將轉(zhuǎn)基因種子播種于MS培養(yǎng)基中，收集14 d的幼苗。將不同的組織及幼苗按照Tang等［19］的方法染色：將樣品放入配好的X-Gluc solution染色液中，真空抽氣15 min后置于37℃條件下16 h，然后利用70%的乙醇脫色。最后，利用倒置顯微鏡拍照。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 利用TSSP在線軟件（http：//linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=tssp&group=-programs&subgroup=promoter）預(yù)測At3NC026490 的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；利用在線軟件PlantCARE （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/） 對啟動子的順式作用元件進(jìn)行分析和功能預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 At3NC026490啟動子序列及作用元件分析

At3NC026490基因位于第3條染色體上，其上游1 004 bp處為另一個lncRNA基因（At3NC026500），它們的轉(zhuǎn)錄方向相同（圖1）。因此我們提取 At3NC026490與At3NC026500之間的DNA序列并利用TSSP在線軟件進(jìn)行TSS位點(diǎn)預(yù)測，結(jié)果顯示在At3NC026490基因上游600 bp處有1個TSS位點(diǎn)。隨后利用PlantCARE網(wǎng)站對該段序列進(jìn)行啟動子作用元件分析及功能預(yù)測，結(jié)果（圖2，彩插一）顯示，該序列具有典型的核心啟動子元件，包含29個TATA-box和21個CAAT-box，其中CAAT-box決定啟動子起始轉(zhuǎn)錄的效率及頻率，可增強(qiáng)啟動子的強(qiáng)度；TATA-box具有定位轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的功能，說明該序列具有啟動子的基本特點(diǎn)。除啟動子基本元件外，該序列還具有多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的作用元件，包括11種光響應(yīng)元件，生長素（TGA-element）、水楊酸（TCA-element）、乙烯（ERE）等響應(yīng)元件，熱響應(yīng)元件（HSE）、逆境響應(yīng)元件（TC-rich repeats） 等，暗示該啟動子可能在響應(yīng)光、激素、逆境脅迫等過程中發(fā)揮作用（表1）。此外，該序列還含有一些特殊的響應(yīng)元件，比如在負(fù)義鏈150 nt處存在胚乳表達(dá)調(diào)控的skn-1_motif元件，在正義鏈953 nt處有1個CCAAT-box （MYBHv1結(jié)合位點(diǎn)）。

圖1 At3NC026490及其兩側(cè)基因的分布

2.2 At3NC026490啟動子的克隆

以擬南芥基因組D N A為模板，利用Gataway技術(shù)對At3NC026490基因上游1 072 bp的序列進(jìn)行克隆，結(jié)果見圖3A（彩插一），克隆片段大小為1 130 bp（Gateway接頭共58 nt），進(jìn)一步測序表明所克隆片段序列與At3NC026490上游序列一致（圖3B，彩插一），說明克隆的基因組片段正確。利用gateway系統(tǒng)的pMDC162構(gòu)建At3NC026490啟動子驅(qū)動GUS基因載體（pAt3NC026490∶∶GUS），轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌中，農(nóng)桿菌菌落PCR檢測結(jié)果見圖3C（彩插一）。然后轉(zhuǎn)入到野生型擬南芥中，通過潮霉素B篩選獲得植株陽性苗（圖3D，彩插一），T1代種子繼續(xù)篩選，進(jìn)一步繁殖后獲取T3代種子后用于GUS染色分析。

表1 At3NC026490基因啟動子順式作用元件

2.3 At3NC026490啟動子功能分析

為了更好地理解At3NC026490在植物各組織的表達(dá)情況，我們挑選2個株系（pAt3NC026490∶∶GUS 2與 pAt3NC026490∶∶GUS 4），對轉(zhuǎn)基因植株的營養(yǎng)生長組織（根、幼苗、蓮座葉與莖生葉）與生殖生長組織（花、果莢及種子）進(jìn)行GUS染色分析。結(jié)果表明，在At3NC026490啟動子的驅(qū)動下，GUS在擬南芥營養(yǎng)組織中的表達(dá)量均很高。由圖4（彩插一）可知，2個轉(zhuǎn)基因株系的蓮座葉、莖生葉以及幼苗與根中出現(xiàn)明顯的GUS表型，說明啟動子能驅(qū)動GUS在這些營養(yǎng)組織中表達(dá)。比較而言，生殖生長組織較少受該啟動子的影響，只在花瓣與果莢中觀察到一定的GUS表型，而在其他花器官和種子中卻沒有出現(xiàn)GUS表型。種子發(fā)育是一個重要的動態(tài)過程，為了進(jìn)一步研究At3NC026490啟動子是否在種子整個發(fā)育與成熟過程發(fā)揮作用，我們對不同發(fā)育時期的果莢與種子（4、7、12、17 d）進(jìn)行GUS染色分析，結(jié)果見圖5（彩插一），盡管在果莢中GUS基因的表達(dá)量一直很高，但是在種子整個發(fā)育過程中沒有觀察到GUS表型，即GUS在種子發(fā)育與成熟過程中并沒有表達(dá)，說明At3NC026490可能并不參與種子的發(fā)育與成熟過程。

生物信息學(xué)預(yù)測At3NC026490啟動子含有多個光響應(yīng)作用元件，我們對轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行8、16、24 h不同光照時間處理，然后觀察14 d幼苗GUS表型的變化，結(jié)果（圖6，彩插一）顯示，8、16、24 h不同光照時間處理下幼苗中GUS表型并無明顯變化，說明在幼苗中At3NC026490啟動子對長短日照具有相似的響應(yīng)。

3 討論

lncRNAs在真核生物中種類豐富且分布廣泛，能夠在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)或直接影響蛋白功能［1-3］。盡管在植物中鑒定了大量的lncRNAs，然而對其功能卻了解甚少。At3NC026490是位于擬南芥第3條染色體上的一個lncRNA，目前尚未見到關(guān)于其功能方面的報道。本研究從啟動子的角度闡釋At3NC026490的功能特性，為揭示At3NC026490的生物學(xué)功能提供了重要信息和研究思路。

啟動子是位于基因上游啟動基因表達(dá)的序列，目前關(guān)于lncRNA基因啟動子的研究還鮮有報道，因此確定At3NC026490啟動子序列是一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究從3個方面確定該啟動子的序列：一是利用生物信息學(xué)手段預(yù)測到了TSS位點(diǎn)；二是該序列中含有啟動子的核心元件CAAT-box和TAAT-box；三是利用該序列驅(qū)動GUS基因，可以在轉(zhuǎn)基因擬南芥中觀察到明顯的GUS表型，結(jié)果表明本研究所克隆的序列確實具有啟動子的功能。

啟動子不僅能夠調(diào)控基因表達(dá)的水平而且決定基因表達(dá)的部位和方式，研究基因啟動子的特性是揭示基因生物學(xué)功能的一條有效途徑。本研究中，我們通過兩種方式闡釋lncRNA啟動子的特性，一方面利用生物信息學(xué)手段預(yù)測該啟動子中含有響應(yīng)光、激素以及脅迫的多種元件，這與許多l(xiāng)ncRNA的表達(dá)受外界環(huán)境調(diào)控的報道相一致［19-20］，表明At3NC026490可能在響應(yīng)激素及外界刺激過程中扮演著重要角色；另一方面，通過啟動子驅(qū)動GUS基因聯(lián)合GUS染色的策略研究該啟動子的特性，結(jié)果表明營養(yǎng)組織中GUS表型明顯，而在生殖生長組織中表型不明顯，這與lncRNA具有組織表達(dá)特異性的報道一致［21-24］，說明At3NC026490可能在營養(yǎng)生長過程中發(fā)揮著重要作用。有趣的是在整個種子發(fā)育過程并未觀察到GUS表型，至少有2個原因?qū)е逻@種可能性：該啟動子（至少是我們克隆的啟動子）可能并不響應(yīng)種子的發(fā)育與成熟，本研究克隆的At3NC026490啟動子沒有包括響應(yīng)種子發(fā)育與成熟的元件。后續(xù)研究將檢測At3NC026490在種子中的表達(dá)情況以確定At3NC026490啟動子是否真正響應(yīng)種子發(fā)育過程。

本研究克隆的啟動子并未響應(yīng)種子發(fā)育過程，這在提高轉(zhuǎn)基因食品安全方面可能具有良好的應(yīng)用前景。后續(xù)研究可利用該啟動子驅(qū)動目標(biāo)基因在待改良的作物中表達(dá)，由于該啟動子可以響應(yīng)營養(yǎng)生長，可以實現(xiàn)對營養(yǎng)生長以及抗性等性狀的改良，同時保證目標(biāo)基因及其融合的篩選標(biāo)記基因在種子中不表達(dá)，從而提高食品的安全性。