基于代謝組學技術(shù)的鹿血與鹿茸血鑒別研究

張然然，王 磊，李 洋，徐佳萍，邢秀梅

(中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所 特種經(jīng)濟動物分子生物學重點實驗室，長春 130112)

鹿血泛指鹿科動物梅花鹿和馬鹿的血液，在《本草綱目》中記載為大補虛損、益精血?，F(xiàn)代研究顯示，鹿血具有延緩衰老[1]、抗疲勞[2]、增強免疫力[3-4]、抗氧化[5-6]等功能，富含蛋白質(zhì)、脂肪酸、維生素等物質(zhì)[7]。鹿茸血是指用真空泵或分離機從新鋸鹿茸中提取出來的血液，鹿茸血稀少而珍貴。其性熱而不燥，補腎壯陽，強筋健骨，生精益髓，含有豐富的必須氨基酸、磷脂、礦物質(zhì)、膠原蛋白、蛋白聚糖、硫酸軟骨素、硫酸葡萄糖胺、透明質(zhì)酸、核苷酸、生長激素等[8]。經(jīng)研究顯示，鹿茸血中的前列腺素、脂肪酸、單胺類物質(zhì)、孕酮、皮質(zhì)醇等含量顯著高于鹿血，而鹿血中的雌二醇、磷脂、多胺類物質(zhì)的含量顯著高于鹿茸血[9]。但也有學者認為，鹿茸血和鹿血具有類似的活性成分與藥理功效。究竟鹿茸血與鹿血的化學成分上有無差異，需要做出全面的分析。

代謝組學是繼基因組學和蛋白質(zhì)組學之后新興的一門學科，是系統(tǒng)生物學的重要組成部分，通過高通量、高分辨率的分析檢測技術(shù)，在整體上分析探討生命活動在代謝層面的特征和規(guī)律[10-12]，基因與蛋白質(zhì)表達的微小變化會在代謝物上得到放大，從而使檢測更容易。近些年，在中藥研究領(lǐng)域得到了廣泛的應用，如潛在活性成分挖掘[13-14]、藥代動力學研究[15]、中藥質(zhì)量控制與鑒別[16-17]等。從分析技術(shù)的角度來看，非靶向代謝組學是盡可能多地定性和相對定量生物體系中的代謝物，最大程度反映總的代謝物信息[18]。色譜-質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS)是以高效液相色譜作為分離系統(tǒng)，高分辨率質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)的一種串聯(lián)分析平臺；與GC-MS技術(shù)相比，LC-MS更適用于分析難揮發(fā)、熱穩(wěn)定性差的代謝物[19]。

目前，超高效液相色譜與四級桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-QTOF-MS)技術(shù)已被廣泛用于非靶向代謝組學的研究，超高效液相色譜應用1.7 μm超細粒徑填料填充的色譜柱，比傳統(tǒng)的HPLC的分析速度、靈敏度、分離度都有顯著的提升。為全面的分析、比較鹿茸血與鹿血的代謝物差異，本研究采用UPLC-QTOF-MS技術(shù)，結(jié)合數(shù)據(jù)依賴采集方式對樣本進行全譜分析，同時獲得一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，隨后對數(shù)據(jù)進行峰提取、統(tǒng)計學分析及代謝物鑒定，以篩選出鹿茸血與鹿血的差異代謝物。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

甲醇、乙腈、醋酸銨、氨水的LCMS級皆購自CNW Technologies；水由純水儀提供。

超高效液相(Agilent 1290 UHPLC, Agilent)，高分辨質(zhì)譜(AB Triple TOF 5600, AB Sciex)，色譜柱(ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm 2.1*100 mm,Waters)，離心機(Thermo Scientific Heraeus Fresco17 centrifuge)，渦旋儀(VORTEX-5, 其林貝爾儀器制造有限公司)，天平(BSA124S-CW，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)，純水儀(明澈 D24 UV, Merck Millipore, Germany)，超聲儀(PS-60AL，深圳市雷德邦電子有限公司)。

1.2 試驗樣品

血液樣品來自于長春東大鹿業(yè)有限公司所飼養(yǎng)的10頭5歲純種東北梅花鹿，這些梅花鹿親緣關(guān)系較近，體型一致，健康狀況良好，連續(xù)3年的產(chǎn)茸量相當，且長期飼養(yǎng)在同一圈舍。鹿茸血為新鮮鹿茸排出血液，鹿血為梅花鹿頸靜脈血液，每組樣品共10份。 血液樣本用添加分離膠的促凝管收集，3 000 r·min-1離心15 min，得到血清樣本。

1.3 代謝物提取

移取100 μL血清樣品至1.5 mL離心管中，加入300 μL甲醇，渦旋混勻30 s，超聲10 min(冰水浴)，-20 ℃ 靜置1 h；之后 4 ℃，13 000 r·min-1離心15 min；小心地取出200 μL上清于2 mL液相色譜進樣瓶，每個樣本各取10 μL混合成QC質(zhì)控樣本，再取60 μL上機檢測。

1.4 上機檢測

試驗所用液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)由Aglient 1290 UPLC串聯(lián)AB Sciex Triple TOF 5600高分辨質(zhì)譜儀組成。所使用的色譜柱為Waters的UPLC BEH Amide 色譜柱 (1.7 μm 2.1*100 mm)。流動相為25 mol·L-1醋酸銨及25 mmol·L-1氨水的水溶液(A液)，純乙腈(B液)。梯度洗脫：0～0.5 min，95% B液；0.5～7 min，95%～65% B液；7～8 min，65%～40% B液；8～9 min，40% B液；9～9.1 min，40%～95% B液；9.1～12 min，95% B液。流速為500 μL·min-1，柱溫40 ℃，正離子掃描模式進樣量3 μL，負離子掃描模式進樣量4 μL。

質(zhì)譜條件：利用AB 5600 Triple TOF質(zhì)譜儀進行一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。質(zhì)譜掃描質(zhì)核比范圍 為100～1 200，轟擊能量：30 eV。離子源(ESI)參數(shù)設(shè)置：霧化氣壓(GS1)為60 Psi，輔助氣壓為60 Psi，氣簾氣壓為35 Psi，溫度為650 ℃，噴霧電壓為5 000 V (正離子掃描模式)，-4 000 V(負離子掃描模式)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

獲得的質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)通過MSconventer軟件轉(zhuǎn)換為mzXML格式，使用XCMS軟件(版本號：1.41.0)做峰尋找、濾噪、樣本間峰匹配、保留時間校正和缺失峰補齊等數(shù)據(jù)處理。使用SIMCA軟件(Version 14.1)對整理好的數(shù)據(jù)進行PCA、OPLS-DA等多元變量模式識別分析。PCA可以揭示數(shù)據(jù)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，從而更好的解釋數(shù)據(jù)變量。而通過OPLS-DA分析，可以過濾掉代謝物中與分類變量不相關(guān)的正交變量，從而獲取更加可靠的代謝物組間差異與試驗組的相關(guān)程度信息。

用VIP(OPLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度)結(jié)合t檢驗(student’st-test)來篩選差異代謝物，再通過離子質(zhì)核比和精確分子量來推斷代謝物的分子式，由分子式及二級質(zhì)譜信息在Metlin數(shù)據(jù)庫中搜索可能的結(jié)構(gòu)。

2 結(jié) 果

2.1 鹿血與鹿茸血代謝產(chǎn)物的鑒定

UPLC-QTOF-MS 獲得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)XCMS軟件[20]做峰尋找、峰對齊、峰過濾等數(shù)據(jù)處理，為保證數(shù)據(jù)的完整性，本研究采用了正、負兩種離子掃描模式。其中在正離子掃描模式下共提取118種化合物，負離子掃描模式下提取到107種化合物。圖1為兩種采集模式下得到的色譜圖，結(jié)果顯示，鹿血與鹿茸血在兩種離子采集模式下，其峰型基本一致。

2.2 鹿血與鹿茸血代謝物多元統(tǒng)計分析

為進一步探究鹿血與鹿茸血在代謝物層面上是否有差異，該試驗運用了多元統(tǒng)計分析，如PCA、OPLS-DA。經(jīng)無監(jiān)督三維 PCA 統(tǒng)計分析結(jié)果顯示(圖2)，大部分鹿血與鹿茸血樣本能夠區(qū)分開來，說明鹿茸血和靜脈血中的代謝物是有區(qū)別的，但分離效果不理想。因而采用有監(jiān)督的模式識別方法—正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)對代謝組數(shù)據(jù)重新進行分析。與無監(jiān)督PCA相比，OPLS-DA能夠?qū)⒔M間差異放大，并得到更好的分類效果。OPLS-DA分析結(jié)果顯示(圖3)，鹿血樣品與鹿茸血樣品分離較為明顯，其中正離子掃描模式下的預測主成分與正交主成分對X變量的累計解釋度R2X(cum)=0.288，對Y變量的累計解釋度R2Y(cum)=0.974，模型的可預測性Q2(cum)=0.762；負離子掃描模式下的預測主成分與正交主成分對X變量的累計解釋度R2X(cum)=0.249，對Y變量的累計解釋度R2Y(cum)=0.984，模型的可預測性Q2(cum)=0.840，說明分離效果較好，進一步證明了鹿血與鹿茸血在小分子代謝物層面上有著明顯區(qū)別。

圖1 UPLC-QTOF-MS檢測總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram detected by UPLC-QTOF-MS

2.3 鹿血與鹿茸血差異代謝物篩選

為進一步深入探究鹿血與鹿茸血小分子代謝物的差異，根據(jù)代謝物的表達量進行差異代謝物篩選，并設(shè)置篩選條件：VIP>1，P<0.05，差異倍數(shù)>1.5倍，其中 VIP代表該物質(zhì)在OPLS-DA模型得到的變量投影重要度。共成功篩選出28種差異代謝物(表1)。其中上調(diào)代謝物有20種，主要為核苷類、有機酸類、脂類等；下調(diào)的有8種，主要為糖類、有機酸類。其中差異倍數(shù)最大的為下調(diào)化合物7-酮基膽固醇與上調(diào)化合物麥角硫因，分別為0.21與3.23倍。

圖2 鹿血組(圓形)對鹿茸血組(方形)的PCA得分散點圖Fig.2 Score scatter plots of PCA model for deer blood (circle) vs. antler blood (square)

圖3 鹿血組(圓形)對鹿茸血組(方形)的OPLS-DA得分散點圖Fig.3 Score scatter plots of OPLS-DA model for deer blood (circle) vs. antler blood (square)

表1差異代謝物信息

Table1Informationsfordifferentiallyexpressedmetabolites

名稱Name得分Score顯著性P-value差異倍數(shù)Fold-change2-羥基腺嘌呤 2-hydroxyadenine0.902.65E-071.76麥角硫因 Ergothioneine0.823.62E-053.23胞嘧啶核苷 Cytidine1.003.41E-052.45尿嘧啶核苷 Uridine0.663.70E-062.84阿卡地辛(藥) Acadesine (Drug)1.002.31E-041.88脯氨酰谷氨酸 Prolyl-glutamate0.967.80E-041.85胞嘧啶核苷 Cytidine0.958.19E-052.25

(轉(zhuǎn)下頁 Carried forward)

3 討 論

鹿茸血與鹿血同樣是名貴的中藥材，而且行駛著類似的藥理作用，但二者在化學成分與藥理療效方面是否有區(qū)別，區(qū)別是什么，迄今為止仍沒有明確的解釋。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，代謝組學也逐漸應用到了中藥領(lǐng)域，主要用于活性物質(zhì)的挖掘、中藥材質(zhì)量控制等方面。

本研究采用基于UHPLC-QTOF-MS技術(shù)的代謝組學方法分析了梅花鹿茸血與鹿血的代謝物差異。試驗結(jié)果顯示，鹿茸血與鹿血在不同個體間存在差異，整體上，鹿茸血與鹿血也存在顯著的差異，但僅是在代謝物的含量上存在差異，代謝物的種類沒有差異，這與前人的研究結(jié)果一致[7]。將篩選出的差異代謝物進行二級質(zhì)譜水平上的鑒定，結(jié)果成功鑒定出了28種代謝物，其中脂類、核苷酸類代謝物在鹿茸血中表達水平較高，而糖類在鹿血中表達水平較高。由于鹿茸血是源于鹿茸組織中的血液，勢必會攜帶鹿茸組織中的某些物質(zhì)，所以推測，鹿茸血中高含量的脂類、核苷酸類代謝物來自于鹿茸組織。其中麥角硫因是差異最為顯著的代謝物之一，查詢文獻得知，麥角硫因是一種天然抗氧化劑[21]，具有清除自由基[22]，解毒，維持DNA生物合成[23]、細胞正常生長及細胞免疫等多種生理功能[24]，主要存在于蘑菇、黑豆、紅豆、燕麥麩等食物中[25]。但至今還沒有動物機體合成麥角硫因的證據(jù)，所以鹿茸血與鹿血中的麥角硫因很可能是來源于飼料。但為何在鹿茸血中的含量高于鹿血還需要進一步的探究。鹿茸血中7-酮基膽固醇含量顯著低于鹿血，其是膽固醇氧化產(chǎn)物的主要成分之一，存在于動物的多種組織中，并具有多種生物學作用，如抑制膽固醇合成酶活性和細胞毒性等，最近研究還顯示，7-酮基膽固醇在動脈粥樣硬化形成、誘導胰島β細胞凋亡過程中也起著重要作用[26]。本研究不僅在代謝組水平上將鹿血與鹿茸血區(qū)分開來，也為鹿血、鹿茸血相關(guān)產(chǎn)品的深度開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，在小分子代謝物種類上鹿血與鹿茸血并無差異，只是在含量上有所差別，而且在OPLS-DA模型上分離明顯。差異代謝物篩選結(jié)果顯示，脂類、核苷酸類代謝物在鹿茸血中的含量較高，天然抗氧化劑麥角硫因也在鹿茸血中的含量較高。