鴨腸炎病毒疫苗株EvaGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立

萬(wàn)春和，劉榮昌，程龍飛，傅光華，施少華，陳紅梅，傅秋玲，黃 瑜

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心/福建省禽病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350013)

鴨病毒性腸炎(duck virus enteritis, DVE)又稱鴨瘟(duck plague, DP)，是由鴨腸炎病毒(duck enteritis virus, DEV)引起的常見于鴨、鵝及其他雁形目禽類的一種急性、高度接觸性傳染病[1]。國(guó)際病毒分類委員會(huì)(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)2011年基于DEV相關(guān)研究將其命名為Anatid alphaherpesvirus 1(鴨皰疹病毒1型)。根據(jù)ICTV的分類方法，鴨皰疹病毒1型屬于皰疹病毒科(Herpesviridae)、α-皰疹病毒亞科(Alphaherpesviridae)、馬立克病毒屬(Mardivirus)[2]。

皰疹病毒基因組龐大，復(fù)制非必需區(qū)多，可容納多個(gè)外源基因的插入，具有良好的開發(fā)基因工程活載體多聯(lián)疫苗前景，已見有馬立克病毒(Marek’s disease virus，MDV)[3]、火雞皰疹病毒(herpesvirus of turkey，HVT)[4]、偽狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)[5]及傳染性喉氣管炎病毒(avian infectious laryngotracheitis virus，ILTV)[6]作為基因工程活載體疫苗的相關(guān)研究報(bào)道。免疫鴨瘟弱毒疫苗是控制鴨瘟的有效措施，該疫苗株是將DEV鴨胚適應(yīng)株在雞胚連續(xù)傳60余代選育而成[7]。DEV弱毒疫苗在我國(guó)用于防控DEV超過(guò)50余年，該疫苗生產(chǎn)技術(shù)成熟、安全無(wú)副作用、誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生快、免疫保護(hù)效果好。此外，DEV弱毒疫苗具有良好的雞胚適應(yīng)性，便于后續(xù)疫苗標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，已成為水禽疫病活載體疫苗研究開發(fā)熱點(diǎn)[8-9]。基于DEV弱毒疫苗株作為活載體來(lái)開發(fā)針對(duì)H5N1亞型禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)血凝素基因(HA)的活載體疫苗(rDEV-H5HA)可抵抗H5AIV和DEV強(qiáng)毒攻擊[10]；針對(duì)禽坦布蘇病毒(avian Tembusu virus，ATmV)E蛋白和PrM蛋白的活載體疫苗(rDEV-PrM/TE)可抵抗ATmV和DEV強(qiáng)毒攻擊[11]；針對(duì)鴨甲肝病毒1型和3型(DHAV-1和DHAV-3)結(jié)構(gòu)蛋白VP1的活載體疫苗(rDEV-2VP1)接種可迅速激發(fā)機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫，3 d 后可完全抵抗DHAV-1、DHAV-3和DEV強(qiáng)毒攻擊[12]，在多聯(lián)禽用(尤其是水禽)活疫苗研發(fā)方面應(yīng)用前景廣闊。

DEV的鑒定有病毒分離、血清中和試驗(yàn)(SN)、瓊脂糖凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、微量固相放射免疫吸附試驗(yàn)(Micro-SPRIA)和反向間接血凝試驗(yàn)(RPHA)等經(jīng)典病毒學(xué)方法。隨著對(duì)DEV基因序列不斷研究深入，針對(duì)DEV多個(gè)基因序列特征的PCR方法、LAMP方法[13]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法均見有相關(guān)研究報(bào)道[14]。隨著DEV作為基因工程載體開發(fā)疫苗研究不斷深入[15]，亟待一種僅針對(duì)DEV疫苗株的特異性檢測(cè)方法用于DEV活載體疫苗免疫機(jī)制評(píng)估相關(guān)研究。本研究基于DEV疫苗株UL2基因特征，設(shè)計(jì)特異性引物，建立了僅檢測(cè)DEV疫苗株EvaGreen的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，現(xiàn)簡(jiǎn)要報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑

病毒核酸提取試劑盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit(貨號(hào)ER201)、細(xì)菌基因組提取試劑盒EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit(貨號(hào)EE161)、PCR擴(kuò)增試劑盒2×TransTaq-T PCR SuperMix (+dye)(貨號(hào)AS122)和T克隆載體試劑盒pEASY-T1 Simple Cloning Kit(貨號(hào)CT111)均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒(貨號(hào)Gel Extraction Kit D2500)和質(zhì)粒小量提取試劑盒I(貨號(hào)Plasmid Mini Kit I D6943)均購(gòu)自O(shè)mega Bio-Tek公司；實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒SsoFastTMEvaGreen(貨號(hào)172-5202)購(gòu)自伯樂(lè)(Bio-Rad)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；熒光定量八排管(PCR-0208-C)購(gòu)自愛思進(jìn)(Axygen)公司；其他常規(guī)化學(xué)試劑、耗材均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)毒株和菌株

鴨腸炎病毒強(qiáng)毒(wild duck enteritis virus，wDEV)、番鴨細(xì)小病毒(muscovy duck parvovirus，MDPV)、鵝細(xì)小病毒(goose parvovirus，GPV)、新型基因重組型鴨細(xì)小病毒(novel recombinant duck parvovirus, N-MDPV)、鴨腺病毒A型(duck adenovirus A，DAdV-A)、鴨源大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)、鴨疫里默菌(Rimerellaanatipstifer，R.A.)和禽多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，P.M.)均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所鑒定并保存。

鴨源鵝多瘤病毒(goose hemorrhagic polyomavirus，GHPV)、鴨圓環(huán)病毒(duck circovirus, DuCV)陽(yáng)性核酸DNA由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所鑒定并保存。

DEV疫苗株(vaccine strain duck enteritis virus，vDEV)購(gòu)自青島易邦生物工程有限公司，疫苗毒株為DEV雞胚化弱毒株(CVCC AV1222)，批號(hào)為160051201，生產(chǎn)日期：20161020。

1.3 UL2基因克隆與序列分析

1.3.1UL2基因分析比較 下載美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)中DEV的UL2基因組序列(見表1)，利用DNAStar軟件對(duì)UL2基因進(jìn)行序列分析，明確DEV強(qiáng)毒和疫苗株UL2基因差異。

1.3.2UL2基因全長(zhǎng)的擴(kuò)增 利用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo (v7.37)，設(shè)計(jì)跨過(guò)UL2基因編碼區(qū)的引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列如下，DEV-UL2F：5′-GATTTCTGGGTTTTTGCTGGAC-3′，DEV-UL2R：5′-TGCAATCACGTTGCGTTGTACT-3′，該引物(DEV-UL2F/DEV-UL2R)對(duì)DEV疫苗株的預(yù)期擴(kuò)增片段大小為783 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3.3 PCR擴(kuò)增和克隆 利用EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取鴨瘟病毒雞胚化弱毒株(CVCC AV1222)核酸DNA，使用“1.3.2”設(shè)計(jì)的UL2基因特異性引物(DEV-UL2F/DEV-UL2R)對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按照2×TransTaq-T PCR SuperMix說(shuō)明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(50 μL)參考試劑盒說(shuō)明書配制，其中2×TransTaq-T PCR SuperMix 25 μL、上/下游引物(DEV-UL2F/DEV-UL2R，20 μmol·L-1)各1 μL、提取核酸DNA 1 μL，補(bǔ)充滅菌去離子水(22 μL)至終體積50 μL?；靹蚝笏矔r(shí)離心后進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 50 s、56 ℃ 35 s、72 ℃ 85 s，35個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸 10 min。用1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，利用膠回收試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行切膠回收后克隆到pEASY-T1 Simple Cloning Kit載體上，篩選出陽(yáng)性重組質(zhì)粒送由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)分析驗(yàn)證，將符合預(yù)期的陽(yáng)性重組質(zhì)粒(T-vDEV)經(jīng)線性化酶切后，作為本研究的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。利用微量核酸測(cè)定儀測(cè)定其濃度后，換算成拷貝數(shù)，進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋后備用。

表1DEV不同毒力UL2基因序列信息

Table1InformationoftheUL2geneofduckenteritisviruswithdifferentvirulence

毒株StrainsGenBank號(hào)GenBank No.長(zhǎng)度/bpLength毒力Virulence地區(qū)Area參考文獻(xiàn)ReferenceC-KCEKF263690474VaccineChinaNot availableKKF263690474VaccineChinaYang等(2014、2015)[9, 16]Attenuated strain 2JQ347518474VaccineChinaNot availableChinese commercial DEV vaccineEF449516474VaccineChinaLi等(2009)[17]Attenuated strain 1JQ347517474VaccineChinaNot availableVACEU082088477VaccineChinaLi等(2009)[17]Yulin/2016/60DKX9254401 002VirulentChinaNot availableYulin/2016/30DKX9254391 002VirulentChinaNot availableCVKJ5496631 002VirulentChinaYang等(2014、2015)[9,16]CHvJQ6475091 002VirulentChinaWu等(2015)[18]2085JF9999651 002VirulentGermanyWang等(2011)[19]N1JQ0432161 002VirulentChinaNot availableN2JQ2485961 002VirulentChinaNot availableN3JQ2485971 002VirulentChinaNot availableLSJQ2485981 002VirulentChinaNot availableLH2011KC4802621 002VirulentChinaNot available

1.4 EvaGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

1.4.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)“1.3.1”中分析的DEV強(qiáng)毒和疫苗株UL2基因特點(diǎn)，利用Oligo(v7.37) 設(shè)計(jì)特異性的EvaGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物，引物序列如下，DEV-EvaF：5′-CAGATTTGACTATTTTTGACCAAC-3′，DEV-EvaR：5′-TAGGCTCCCGTCTCCGTCCCA-3′，預(yù)期片段大小為101 bp。

1.4.2 反應(yīng)條件優(yōu)化 以含有DEV疫苗株UL2基因陽(yáng)性重組質(zhì)粒(質(zhì)粒濃度為5.25×106拷貝·μL-1)為模板，按照熒光定量試劑盒SsoFastTMEvaGreen試劑盒說(shuō)明書配制20 μL的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，在不同引物終濃度(200、300、400、500和600 nmol·L-1)對(duì)退火/延伸溫度(56、58、60、62和64 ℃)進(jìn)行優(yōu)化，循環(huán)結(jié)束后，制作對(duì)應(yīng)的熔解曲線，確定建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的最優(yōu)反應(yīng)條件。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 分別以不同質(zhì)粒含量(5.25×106～5.25×101拷貝·μL-1，共6個(gè)稀釋度)作為實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒模板，用優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)(lgC)為橫坐標(biāo)，以循環(huán)數(shù)閾值(cycle threshold，Ct值)為縱坐標(biāo)，推導(dǎo)計(jì)算出實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程(標(biāo)準(zhǔn)曲線)。

1.4.4 特異性試驗(yàn) 用優(yōu)化后最優(yōu)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件分別對(duì)其他常見鴨源病原(核酸類型為DNA)(如wDEV、MDPV、DuCV、GPV、N-MDPV、DVE、DAdV-A、GHPV、E.coli、R.A.和P.M.)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，評(píng)價(jià)建立方法的特異性。用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取相應(yīng)病毒株(wDEV、MDPV、DuCV、GPV、N-MDPV、DVE、DAdV-A和GHPV)核酸DNA、用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取相應(yīng)病菌株(E.coli、R.A.和P.M.)基因組DNA。

1.4.5 敏感性試驗(yàn) 分別連續(xù)倍比稀釋質(zhì)粒(含量為5.25×104～5.25×100拷貝·μL-1，共5個(gè)稀釋度)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒作為EvaGreen實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的模板，用優(yōu)化后最優(yōu)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)，確定建立的實(shí)時(shí)熒光定量方法的最小檢測(cè)限。同時(shí)進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，評(píng)價(jià)兩者的靈敏性。

1.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 用優(yōu)化后最優(yōu)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒(含量為5.25×106～5.25×101拷貝·μL-1，共6個(gè)稀釋度)分別進(jìn)行檢測(cè)，每種標(biāo)準(zhǔn)品含量重復(fù)3次，計(jì)算組內(nèi)(intra-group)變異系數(shù)。分別將上述標(biāo)準(zhǔn)品分裝后置于-20 ℃保存，每隔7 d取出，共檢測(cè)3次，計(jì)算組間(inter-group)變異系數(shù)。

1.5 臨床應(yīng)用

對(duì)10 d番鴨(5只)每只腿肌免疫注射0.25 mL(含1羽份)鴨瘟活疫苗(購(gòu)自青島易邦生物工程有限公司)，5 d后采集其肝和食道黏膜刮取物，按常規(guī)方法研磨處理后，用EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取核酸DNA后，用優(yōu)化后最優(yōu)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3次。

2 結(jié) 果

2.1 UL2基因特征

2.1.1UL2基因比較 經(jīng)分析比對(duì)，DEV強(qiáng)毒株UL2基因長(zhǎng)度均為1 002 bp，編碼333個(gè)氨基酸；而DEV疫苗株UL2基因長(zhǎng)度均為474 bp(除VAC株外，其長(zhǎng)度為477 bp)，編碼157個(gè)氨基酸。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，DEV疫苗株和強(qiáng)毒株相比存在一個(gè)528 bp缺失。DEV疫苗株在DEV強(qiáng)毒株第196—723位核苷酸缺失(見圖1)，即連續(xù)缺失176個(gè)氨基酸，缺失的氨基酸序列如下：GFVACMREGGGIAQQPQTSNSSGRGEVAPSWFNSPTEWEKLSGDYCIGDAWRE- VLYQELQSEVGSRVLLEYERRCDIEEVLPPKN-EIFTWTRYCAPSDVKVIIVGQDPYHQPGQAH-GLAFSVRRGIQIPPSLRNILSAVRRSYPETKIVD-HGCLEAWAKAGVLLLNTTLTVRKGHP。

圖1 DEV 強(qiáng)毒株和疫苗株UL2基因差異模式圖Fig.1 The schematic organization for UL2 gene of DEV virulent and vaccine strain

2.1.2UL2基因核苷酸相似性比較 分析10株DEV強(qiáng)毒UL2基因，其核苷酸序列完全一致，核苷酸相似性為100%；對(duì)DEV疫苗株(除VAC株外，其長(zhǎng)度為477 bp)分析發(fā)現(xiàn)，其核苷酸相似性在99.8%以上，僅attenuated strain 1株在第4位存在1個(gè)核苷酸差異。

2.2 優(yōu)化后的EvaGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR條件

優(yōu)化后的EvaGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法最佳反應(yīng)體系(20 μL)如下：EvaGreen Mix 10 μL、上/下游引物(終濃度為300 nmol·L-1)0.2 μL、模板2 μL，補(bǔ)充滅菌去離子水至終體積20 μL。優(yōu)化出的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法最佳反應(yīng)條件： 98 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃ 10 s，62 ℃退火/延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，制作對(duì)應(yīng)的熔解曲線。

2.3 EvaGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

從不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線可見，建立的EvaGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法在5.25×101～ 5.25×106拷貝·μL-1反應(yīng)范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999，擴(kuò)增效率為100%。以每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品模板中拷貝數(shù)的常用對(duì)數(shù)(lgC)為橫坐標(biāo)，以出現(xiàn)的循環(huán)數(shù)閾值(Ct值)結(jié)果為縱坐標(biāo)，獲得基于EvaGreen檢測(cè)DEV實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2)的Y軸截距為34.95，斜率為-3.218，表明建立的EvaGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性分析

從擴(kuò)增曲線(圖3a)可見，優(yōu)化后的EvaGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法僅對(duì)DEV疫苗株檢測(cè)出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增，對(duì)其他常見鴨源病原(如wDEV、MDPV、DuCV、GPV、N-MDPV、DVE、DAdV-A、GHPV、E.coli、R.A.和P.M.)均未見陽(yáng)性熒光信號(hào)擴(kuò)增。

從熔解曲線分析(見圖3b)可見，建立的EvaGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法僅對(duì)vDEV檢測(cè)在Tm=(90.62±0.28)℃出現(xiàn)單一的特異性峰，無(wú)引物二聚體及非特異性產(chǎn)物。對(duì)其他常見鴨源病原(如wDEV、MDPV、DuCV、GPV、N-MDPV、DVE、DAdV-A、GHPV、E.coli、R.A.和P.M.)均未見特異性峰值，表明建立的EvaGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法特異性強(qiáng)。

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve for the real-time PCR of duck enteritis virus vaccine strain

a.擴(kuò)增曲線；b.熔解曲線；1. vDEV；2. 對(duì)照病原: wDEV、MDPV、DuCV、GPV、N-MDPV、DVE、DAdV-A、GHPV、E. coli、R.A.和P.M.，因沒有擴(kuò)增信號(hào)，無(wú)法區(qū)分具體條帶線a. Amplification curve; b. Melting curve; 1. vDEV；2. Control pathogens: wDEV,MDPV,DuCV,GPV,N-MDPV,DVE,DAdV-A,GHPV,E. coli,R.A.和P.M. (Because there is no amplification signal, the experimental control cannot distinguish the specific stripe line)圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性分析Fig.3 Specific analysis of real-time fluorescent quantitative PCR

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的靈敏性試驗(yàn)

用建立的EvaGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)不同濃度質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示(見圖4)其最低檢測(cè)限為5.25×101拷貝·μL-1(圖4a)，常規(guī)PCR檢測(cè)限為5.25×103拷貝·μL-1(圖4b)，表明建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法較常規(guī)PCR方法更敏感。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的重復(fù)性

將不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行組內(nèi)和組間的重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示(表2)組內(nèi)變異系數(shù)為0.55%～1.72%，組間變異系數(shù)0.92%～2.49%，Ct值變異系數(shù)均在2.5%以內(nèi)，表明本研究建立的實(shí)時(shí)定量PCR方法重復(fù)性好。

a. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法；b.常規(guī)PCR；1～5. 5.25×104～5.25×100 copies·μL-1 vDEV質(zhì)粒; M. 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)a. Real-time fluorescent quantitative PCR; b. Conventional PCR; 1-5. vDEV plasmids with the concentration of 5.25×104 to 5.25×100 copies·μL-1; M. DNA marker圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的敏感性分析Fig.4 Sensitivity analysis of the real-time fluorescent quantitative PCR

表2EvaGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR的組內(nèi)和組間變異系數(shù)

Table2Reproducibilitytestofintra-andinter-assayfortheEvaGreenreal-timePCR

標(biāo)準(zhǔn)拷貝數(shù)Standard copy number組內(nèi)Intra-group組間Inter-group循環(huán)數(shù)Ct方差SD變異系數(shù)/% CV循環(huán)數(shù)Ct方差SD變異系數(shù)/% CV5.25×10615.190.100.6615.230.140.925.25×10519.080.110.5519.130.180.925.25×10423.360.170.7323.600.261.115.25×10326.670.230.8726.840.371.375.25×10230.430.371.2030.620.531.735.25×10134.050.591.7234.210.852.49

2.7 臨床樣品的檢測(cè)

分別采集免疫5 d后番鴨的肝和食道黏膜刮取物，按常規(guī)方法處理后，提取其核酸，用優(yōu)化的條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，每個(gè)樣品檢測(cè)三次。結(jié)果經(jīng)計(jì)算表明，5只番鴨肝和食道黏膜均檢測(cè)到陽(yáng)性擴(kuò)增信號(hào)，番鴨肝中DEV疫苗株平均含量為7.32×105拷貝·μL-1，食道黏膜中平均含量為9.32 ×105拷貝·μL-1。

3 討 論

隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，已見有多株DEV基因組序列研究報(bào)道，通過(guò)分析比較DEV強(qiáng)毒株和疫苗株基因特征，為尋找DEV鑒別診斷方法提供參考。DEV 的UL2 是單純皰疹病毒 1 型(herpes simplex virus type 1，HSV-1)的UL2同源基因，后者編碼尿嘧啶 DNA 糖基化酶(uracil-DNA glycosylase，UDG)，是一個(gè)非必需基因，在DNA復(fù)制過(guò)程中可將dUTP錯(cuò)誤插入或是胞嘧啶的脫氨基造成的尿嘧啶殘基切除，保證DNA復(fù)制的正確性和順利進(jìn)行[20-21]。從UL2基因特征來(lái)看，DEV疫苗株UL2基因均為474 bp(除VAC株外)，核苷酸序列十分保守；而強(qiáng)毒株UL2基因全長(zhǎng)均為1 002 bp，核苷酸序列完全一致，但尚未見研究證實(shí)該缺失和DEV毒力差異相關(guān)。但基于該特征性差異，已建立DEV強(qiáng)毒株和疫苗株的鑒別診斷方法[22-23]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。常用的熒光物質(zhì)有熒光探針和熒光染料。熒光染料主要有不飽和熒光染料(主要是SYBR GreenⅠ)和飽和熒光染料(主要是EvaGreen)兩類。EvaGreen和SYBR GreenⅠ具有相似的光譜特性，但是EvaGreen對(duì)PCR的抑制性遠(yuǎn)小于SYBR Green Ⅰ，比傳統(tǒng)DNA聚合酶具有更快的速度和更短的反應(yīng)時(shí)間，而不會(huì)影響實(shí)時(shí)熒光定量PCR的靈敏度、效率和重復(fù)性，可極大地降低反應(yīng)時(shí)間[24-25]。

當(dāng)前，建立檢測(cè)DEV核酸的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，無(wú)法科學(xué)有效地區(qū)分DEV強(qiáng)毒株和疫苗株。本研究通過(guò)對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中DEV強(qiáng)毒株和疫苗株UL2基因序列進(jìn)行分析比較，明確DEV強(qiáng)毒株和疫苗株UL2基因存在特異性核苷酸差異，并基于該差異設(shè)計(jì)特異性的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，經(jīng)條件優(yōu)化后建立基于EvaGreen飽和熒光染料的僅特異性檢測(cè)DEV疫苗株的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。該方法特異性強(qiáng)，僅對(duì)DEV疫苗株檢測(cè)出現(xiàn)陽(yáng)性熒光信號(hào)，對(duì)其他鴨群常見傳染病病原均無(wú)交叉反應(yīng)；靈敏度高，最低檢測(cè)限僅為52.5拷貝 ·μL-1；重復(fù)性好，組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)和組間重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)均較低(最高僅為1.72%和2.49%)。本研究建立的特異性檢測(cè)DEV疫苗株的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，為后續(xù)開展DEV致弱機(jī)制和DEV活載體基因工程疫苗免疫防控機(jī)制研究提供參考。

4 結(jié) 論

基于DEV強(qiáng)毒和活疫苗株UL2基因差異，建立了特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好的EvaGreen檢測(cè)DEV疫苗株的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。