應(yīng)用多重實(shí)時熒光PCR方法對8種動物毛纖維種類鑒別的研究

劉艷艷，范陽陽，步 迅，胡 悅，東野升金，譚晴晴，張全芳

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心/山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院應(yīng)用生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100)

動物毛絨纖維是畜牧業(yè)的重要畜產(chǎn)品和紡織工業(yè)的高檔紡織原料，具有彈性好，吸濕性好，保暖性好，光澤柔和等優(yōu)點(diǎn)[1]。由于各種纖維紡織性能、市場價格差異較大，市場上許多動物毛絨制品出現(xiàn)了摻假現(xiàn)象[2]，動物毛纖維快速鑒別標(biāo)準(zhǔn)的建立已成為消費(fèi)者和執(zhí)法者關(guān)注的焦點(diǎn)。經(jīng)調(diào)查，動物毛絨纖維摻假：向狐貍、貉子等高端昂貴的動物毛纖維中摻入大量羊毛、兔毛等價格較低的動物纖維，或者是利用合成的纖維來冒充[3]。由于在原料和產(chǎn)品的監(jiān)管上缺乏統(tǒng)一的檢測標(biāo)準(zhǔn)，消費(fèi)者難辨真?zhèn)危瑢Υ蟊娫斐珊艽蟮慕?jīng)濟(jì)損失，也嚴(yán)重影響了生產(chǎn)廠家的信譽(yù)，擾亂了市場秩序。因此如何快速、準(zhǔn)確地鑒定貂、狐貍等各種高端動物毛纖維真?zhèn)危瑢τ诰S護(hù)市場的健康穩(wěn)定發(fā)展、維護(hù)消費(fèi)者的合法權(quán)益及監(jiān)督管理技術(shù)保障等方面都具有重要的意義。

對于動物毛纖維源性成分的鑒定主要是通過感官和掃描電鏡法等傳統(tǒng)手段和觀察微觀結(jié)構(gòu)來鑒別，如李維紅和吳建平[4]利用掃描電鏡檢測野生雜皮動物毛皮種類，郭海濤等[5]利用紅外光譜對毛發(fā)的分析。從1988年開始，德國和英國的生物學(xué)專家就證實(shí)了可以從動物毛纖維中提取DNA[6-7]。隨后漸漸出現(xiàn)了從動物毛纖維中提取DNA,并進(jìn)行PCR擴(kuò)增來鑒定動物毛的方法[8-9]，已有的動物毛纖維檢測鑒定標(biāo)準(zhǔn)有羊毛(羊絨)源性成分鑒定[10-11]，Tang等[12]采用Real-time PCR技術(shù)，設(shè)計2套針對羊絨和羊毛的探針和引物對。2004年，印度科學(xué)家Subramanian等[13]利用PCR-RFLP技術(shù)和綿羊、山羊線粒體核酸序列的差異成功建立了羊毛與羊絨的鑒別方法。近年的檢測應(yīng)用基于熒光定量PCR的兔毛[14-15]、狐貍毛[15]纖維定性檢測方法。

感官和掃描電鏡法的主觀性較強(qiáng)，要求有較多的從業(yè)經(jīng)驗(yàn)，而且出錯率高，已不能滿足目前面臨的魚龍混雜的原料檢測需求[16]。從DNA層面的檢測方法多樣但物種單一，而對于水貂、狐貍、羊、駱駝、牛、兔等動物毛纖維的源性成分鑒定還沒有統(tǒng)一的檢測方法。本研究采用改進(jìn)的動物毛纖維DNA提取方法，根據(jù)水貂、狐貍、駱駝、兔、山羊、綿羊、鴨和鵝8種動物的特異核苷酸序列設(shè)計通用PCR引物和特異熒光探針，并建立多重實(shí)時熒光PCR檢測體系，以鑒定動物毛纖維的源性成分，為市場上區(qū)分動物毛纖維的真?zhèn)翁峁┯行У蔫b別依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

動物組織提取試劑盒(D3396)為OMEGA產(chǎn)品。2×Taq Man Master Mix為DBI Bioscience產(chǎn)品。20 mg·mL-1蛋白酶K溶液、RNA酶、二硫蘇糖醇(DTT)和Chelex-100樹脂購自Sigma公司，引物與探針由生工生物工程(上海)有限公司合成。超高效硅珠純化DNA提取試劑盒購自天津諾維萊博科技有限公司。

實(shí)時熒光PCR儀(ABI-7500)，電子天平(余姚記銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司，JM-A10002)，高壓滅菌鍋(申安，LDZX-50KBS)，臺式離心機(jī)(Eppendorf5810)，振蕩儀(杭州瑞城，TS100)。

1.2 材料

水貂皮、狐貍皮、兔皮、山羊絨、綿羊毛、駱駝絨、鵝毛和鴨毛采自山東某些毛皮動物及畜禽養(yǎng)殖場。

1.3 方法

1.3.1 毛纖維DNA提取方法優(yōu)化 毛干部位的DNA提?。涸谶M(jìn)行動物毛纖維DNA裂解之前，首先取30 mg動物毛纖維用70%乙醇清洗1次，再用蒸餾水清洗2次，采用液氮研磨法將毛干研磨成粉末。然后稱取3 mg置于2 mL的離心管中，添加400 μL的DNA細(xì)胞裂解液，10 μL蛋白酶K，10 μL二硫蘇糖醇(DTT)，充分混勻，放置恒溫振蕩儀56 ℃ 800 r·min-1裂解3～5 h。

1.3.1.1 方法1：裂解完成后，采用酚氯仿抽提法對DNA進(jìn)行抽提和純化，具體操作參考楊芳芳等[17]方法。

1.3.1.2 方法2：裂解完成后，加入100 μL 5% Chelex-100樹脂，煮沸8 min，8 000 r·min-1離心3 min，取上清置于1.5 mL EP管中。采用硅珠吸附法DNA純化試劑盒進(jìn)行純化DNA。

1.3.1.3 方法3：采用OMEGA生物公司動物組織提取試劑盒(D3396)。

1.3.1.4 毛囊部位的DNA提?。翰捎肙MEGA生物公司動物組織提取試劑盒操作說明進(jìn)行提取。

1.3.2 DNA濃度及純度測定 將水貂、狐貍、兔、山羊、綿羊、駱駝、鵝和鴨共8種動物毛纖維的基因組DNA 用紫外分光光度法檢測提取DNA濃度和純度。測定并記錄其在OD260 nm和OD280 nm吸光值，OD260 nm/OD280 nm比值為1.7～1.9，試驗(yàn)用DNA濃度為0.1～50.0 ng·μL-1。用于PCR反應(yīng)的DNA溶液A260 nm/A280 nm比值>1.5，如<1.5則重新提取。

1.3.3 設(shè)計PCR引物序列和特異性探針序列 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已公布的水貂、狐貍、駱駝、兔、山羊、綿羊、鴨和鵝的線粒體16SrRNA基因組序列(每個物種不同品種的線粒體16SrRNA基因序列都下載)，使用Primer 5.0軟件在保守區(qū)設(shè)計通用引物，使用Primer 3.0軟件在可變區(qū)設(shè)計相應(yīng)的特異性探針，設(shè)計的探針必須滿足種間特異種內(nèi)保守原則。應(yīng)用TaqMan探針的熒光定量PCR反應(yīng)，退火溫度為60 ℃，探針的退火溫度比引物的退火溫度高約10 ℃。通過比較確定用于8種動物源性DNA的定性檢測的通用引物組合為UNF/UNR，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為228～241 bp。以16SrRNA基因作為內(nèi)參靶基因，設(shè)計可同時擴(kuò)增哺乳類動物及禽類的通用引物及通用探針，作為PCR內(nèi)參質(zhì)控體系，可有效驗(yàn)證提取的基因組DNA質(zhì)量，避免出現(xiàn)假陰性，引物序列及探針序列見表1。

1.3.4 優(yōu)化確定PCR反應(yīng)體系和條件

1.3.4.1 單重實(shí)時熒光PCR檢測方法建立：建立單重PCR體系：以8種供試動物毛纖維基因組DNA為研究對象，反應(yīng)體系采用20 μL，2×qPCR Master Mix 10 μL，對引物的濃度、探針濃度及退火溫度進(jìn)行篩選，以確定最佳的濃度和退火溫度。首先將探針終濃度設(shè)定為0.20 μmol·L-1，引物設(shè)置4個加樣梯度，分別為0.25、0.50、0.75、1.00 μmol·L-1；然后將引物設(shè)置為0.25 μmol·L-1，探針設(shè)置4個梯度的加樣量分別為0.10、0.20、0.40、0.80 μmol·L-1，每個梯度設(shè)置3個平行樣。針對每條探針進(jìn)行溫度梯度試驗(yàn)，退火溫度以2 ℃的梯度遞增，分別設(shè)置為58、60、62和64 ℃。每次試驗(yàn)采取等量的模板，根據(jù)Ct值、熒光信號和平臺期等因素作為參考。

1.3.4.2 多重實(shí)時熒光PCR檢測方法建立：以提取并用紫外分光光度計檢測好的DNA為模板，根據(jù)上述單重?zé)晒釶CR優(yōu)化好的引物、探針濃度和退火溫度進(jìn)行組合，按照優(yōu)化好的反應(yīng)條件進(jìn)行多重?zé)晒釶CR反應(yīng)。采用PCR體系A(chǔ)(包括水貂、狐貍和兔的混合探針)、PCR體系B(包括駱駝、山羊和綿羊的混合探針)和PCR體系C(包括鴨和鵝的混合探針)同時進(jìn)行特異檢測。實(shí)時熒光PCR反應(yīng)條件隨儀器不同略有改變，如使用ABI-7500熒光定量PCR儀程序：95 ℃ 3 min； 95 ℃ 10 s， 62 ℃ 35 s(收集熒光信號)，40個循環(huán)。

1.3.5 方法驗(yàn)證

1.3.5.1 DNA特異性試驗(yàn)：用建立好的多重PCR體系對水貂、狐貍、兔、駱駝、山羊、綿羊、牛、豬、馬、貉子、狗、驢、雞、鴨、鵝、魚和玉米共17種物種的基因組DNA進(jìn)行特異性驗(yàn)證。用NanoDrop2000紫外分光光度計檢測濃度，統(tǒng)一稀釋到10 ng·μL-1左右，每個樣本做3次平行樣。

1.3.5.2 DNA靈敏度試驗(yàn)：將水貂、狐貍、兔、山羊、綿羊、駱駝、鵝、鴨共8種動物毛纖維的基因組DNA模板濃度定為0.200 0、0.020 0、0.002 0和0.000 2 ng·μL-1，設(shè)立3個平行樣，每個反應(yīng)取5 μL模板量，即DNA用量分別為1.000、0.100、0.010、0.001 ng，進(jìn)行多重PCR檢測、評價DNA檢測靈敏度。

1.3.5.3 方法檢出限的確立：根據(jù)各國的標(biāo)識制度確定實(shí)時熒光PCR檢測方法的檢出限。根據(jù)閾值范圍設(shè)定5.0%、1.0%、0.5%和0.1% 4個濃度(質(zhì)量比)作為實(shí)時熒光PCR法的檢出限的評估標(biāo)準(zhǔn)。以雞或魚的DNA樣本為背景基質(zhì)對目標(biāo)樣本進(jìn)行摻雜，分別制備5.0%、1.0%、0.5%和0.1% 4個濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的各標(biāo)準(zhǔn)樣品，每種標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)測試3次。為了進(jìn)一步確認(rèn)實(shí)時熒光PCR法的DNA檢測靈敏度，在0.10%和0.01%的評估標(biāo)準(zhǔn)下，每個樣品重復(fù)10次。

表18種動物毛纖維源性實(shí)時熒光PCR定性檢測所用引物和探針序列

Table1Primerandprobesequencesforqualitativedetectionof8animalhairfiber-derivedreal-timefluorescencePCR

引物和探針名稱Primer and probe name縮寫Abbreviation序列(5'→3')Sequence擴(kuò)增片段/bpAmplified fragment上游通用引物Universal primer-forwardUNFAAGACGAGAAGACCCTTGGACTTTA228～241下游通用引物Universal primer-reverseUNRGATTGCGCTGTTATCCCTAGGGTA上游內(nèi)參引物 Internal reference primer-forward16SFCCTAGCGATAACAGGGCAATC125下游內(nèi)參引物Internal reference primer-reverse16SRTTAAGCCTTGAACAAACGAACC內(nèi)參探針I(yè)nternal reference probe16SP5'CY5-ACGACCTCGATGTTGGATCAGGAC-3' BHQ2水貂探針Mink probeSD-P5'ROX-TCTAACACAACATTATTACTGGGT-3'BHQ2狐貍探針Fox probeHL-P5'FAM-CAAACCCCTCCGGGAATAACTTACT-3'DAB兔探針Rabbit probeTU-P5'JOE-TACAATGAGCCTAACCAAGGAAATCCC-3'BHQ2駱駝探針Camel probeLT-P5'FAM-ATAACCGCCAAGGGATAATAATCTTCTACC-3' DAB山羊探針Goat probeSY-P5'ROX-TATGGACTAGCAGTTTTGGTTGGGG-3'DAB綿羊探針Sheep probeMY-P5'JOE-CCACCAAGGGATAACAACACTCTGGTGG-3' BHQ2鴨探針Duck probeYA-P5'JOE-CGGGGCTACAGACATCGCAGAG-3' BHQ2鵝探針Goose probeE-P5'FAM-ACTGGGGCCACTACCATCGC-3' DAB

1.3.6 模擬混合樣本檢測 狐貍毛纖維中分別摻入0.5%、1.0%、5.0%、10.0%、20.0%、50.0%兔毛纖維，提取混合樣本基因組DNA，進(jìn)行多重實(shí)時熒光PCR檢測；駱駝毛纖維中分別摻入0.5%、1.0%、5.0%、10.0%、20.0%、50.0%綿羊毛纖維，提取混合樣本基因組DNA，進(jìn)行多重實(shí)時熒光PCR檢測；鴨毛纖維中分別摻入0.5%、1.0%、5.0%、10.0%、20.0%、50.0%鵝毛纖維，提取混合樣本基因組DNA，進(jìn)行多重實(shí)時熒光PCR檢測。

2 結(jié) 果

2.1 DNA提取方法比較

將3種方法提取的8種動物毛纖維基因組DNA利用紫外分光光度計檢測其核酸的濃度和純度(表2)，結(jié)果表明：方法1對于只有毛干的駱駝毛提取效果較差，檢測不到濃度。方法3雖然能將8個 動物毛纖維DNA提取出來，但是濃度高低差別較大。優(yōu)化的方法2提取的DNA濃度在10～20 ng·μL-1，純度優(yōu)于方法1和3。另外，以水貂源性和兔源性為例，通過實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增比較其擴(kuò)增曲線發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化的方法2(用硅珠純化提取動物毛纖維DNA)效果最佳，見圖1和圖2。

2.2 實(shí)時熒光定量PCR引物的選擇

分別以提取水貂、狐貍、駱駝、兔、山羊、綿羊、鴨和鵝的基因組DNA為模板，以表1中的通用引物，用染料法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其結(jié)果擴(kuò)增曲線見圖3A。8種物種的擴(kuò)增曲線均正常，說明通用引物擴(kuò)增良好；8種物種的熔解曲線均為單一峰值(圖3B)，說明通用引物特異性強(qiáng)。同時還利用DNA測序進(jìn)行驗(yàn)證，其所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對均與目標(biāo)物種一致。

表28種動物基因組DNA純度及濃度

Table2Purityandconcentrationof8animalsgenomicDNA

樣品Sample方法1 Method 1方法2 Method 2方法3 Method 3A260 nm/A280 nm濃度/(ng·μL-1)ConcentrationA260 nm/A280 nm濃度/(ng·μL-1)ConcentrationA260 nm/A280 nm濃度/(ng·μL-1)Concentration水貂Mink1.199.181.9616.491.225.71狐貍Fox2.261.661.9416.551.439.94兔Rabbit1.951.501.9517.211.636.63駱駝Camel0.000.001.8211.671.168.85山羊Goat1.534.361.8125.751.1312.99綿羊Sheep1.238.031.8015.871.367.70鴨Duck3.503.292.0520.441.337.93鵝Goose3.002.862.0514.421.2219.79

FAM.狐貍源性探針；JOE.兔源性探針；ROX.水貂源性探針；CY5.內(nèi)參探針。下同F(xiàn)AM.The fox-derived probe;JOE. The rabbit-derived probe;ROX. Mink-derived probe;CY5. Internal reference probe.The same as below圖1 不同方法提取的水貂源性DNA的實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增曲線Fig.1 Real-time fluorescence PCR amplification curve of mink-derived DNA extracted by different methods

圖2 不同方法提取的兔源性DNA的實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增曲線Fig.2 Real-time fluorescence PCR amplification curve of rabbit-derived DNA extracted by different methods

圖3 8種物種的擴(kuò)增曲線(A)和熔解曲線(B)Fig.3 The amplification curves (A) and melting curves (B) of 8 species

2.3 優(yōu)化確定PCR反應(yīng)體系和條件

引物為0.75、1.00 μmol·L-1時擴(kuò)增曲線信號明顯高于0.25、0.50 μmol·L-1，探針擴(kuò)增曲線信號隨著濃度的增加逐漸增強(qiáng)，同時引物及探針濃度會影響擴(kuò)增效率，初步確定引物濃度0.50 μmol·L-1，根據(jù)探針信號強(qiáng)度差異優(yōu)化濃度，最終構(gòu)建3組多重PCR體系鑒定8種毛纖維動物源性，20 μL PCR反應(yīng)體系：2×TaqManMaster Mix 10 μL，10× Primer Mix 2 μL，10× Probe Mix 2 μL，DNA模板 2 μL(濃度為0.2～100.0 ng·μL-1)，ddH2O 4 μL，3組多重PCR體系探針及引物終濃度為0.1～0.5 μmol·L-1。最佳反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min； 95 ℃ 10 s， 62 ℃ 35 s(收集熒光信號)，40個循環(huán)。

2.4 多重PCR體系方法驗(yàn)證

2.4.1 特異性驗(yàn)證 用建立好的多重PCR體系對水貂、狐貍、兔、駱駝、山羊、綿羊、牛、豬、馬、貉子、

狗、驢、雞、鴨、鵝、魚和玉米共17種物種的基因組DNA進(jìn)行特異性驗(yàn)證。

2.4.1.1 多重PCR體系組合A(包括水貂、狐貍和兔混合探針)，只對應(yīng)的對水貂、狐貍和兔DNA為模板時才有熒光信號，且Ct值<35，其他樣品均沒有熒光信號，表明體系A(chǔ)具有良好的擴(kuò)增特異性(圖4A)。

2.4.1.2 多重PCR體系組合B(包括駱駝、山羊和綿羊混合探針)，只對應(yīng)的對駱駝、山羊和綿羊DNA為模板時才有熒光信號且Ct值<35，其他樣品均沒有熒光信號，表明體系B具有良好的擴(kuò)增特異性(圖4B)。

2.4.1.3 多重PCR體系組合C(包括鴨、鵝混合探針)，只對應(yīng)的對鴨、鵝DNA為模板時才有熒光信號，且Ct值<35，其他樣品均沒有熒光信號，表明體系C具有良好的擴(kuò)增特異性(圖4C)。

圖4 3組(A、B和C)多重PCR體系的擴(kuò)增曲線Fig.4 Amplification curves of multiplex PCR system in 3 groups (A, B and C)

2.4.2 靈敏度檢測 將水貂、狐貍、兔、山羊、綿羊、駱駝、鵝和鴨共8種動物毛纖維的基因組DNA模板濃度定為0.200 0、0.020 0、0.002 0和0.000 2 ng·μL-1，設(shè)立3個平行樣，每個反應(yīng)取5 μL模板量，即DNA用量分別為1.000、0.100、0.010、0.001 ng。qPCR反應(yīng)結(jié)果見圖5，當(dāng)基因組DNA模板含量≥0.010 ng時均有擴(kuò)增曲線、Ct值<35，當(dāng)基因組DNA模板含量為0.001 ng時無擴(kuò)增曲線，所以DNA靈敏度為0.010 ng。

2.4.3 模擬混合樣本檢測 模擬混合樣本的檢測結(jié)果見表3～5，表3表明，狐貍毛纖維中分別摻入1.0%、5.0%、10.0%、20.0%、50.0%的毛纖維時兔毛均能被檢出，摻入0.5%未被檢出；從表4可看出駱駝毛纖維中摻入1.0%、5.0%、10.0%、20.0%、50.0%的綿羊毛纖維時均能被檢出，摻入0.5% 未被檢出；從表5可看出鵝毛纖維中摻入1.0%、5.0%、10.0%、20.0%、50.0%的鴨毛纖維時均能被檢出，摻入0.5%未被檢出。說明本方法檢出限為1.0%。

A～H. 水貂、狐貍、兔、駱駝、山羊、綿羊、鵝和鴨A-H. Mink, fox, rabbit, camel, goat, sheep, goose and duck圖5 8種動物毛纖維DNA靈敏度擴(kuò)增曲線Fig.5 DNA sensitivity amplification curves of 8 animal hair fibers

3 討 論

研究和開發(fā)動物毛纖維的DNA檢測技術(shù)，關(guān)鍵技術(shù)難點(diǎn)在于動物毛纖維DNA的提取[18]，動物毛發(fā)由毛干和毛根構(gòu)成，雖然毛根帶有毛囊DNA含量豐富，但是經(jīng)過染色等初加工處理的動物纖維樣本多缺失毛囊，而毛干主要由蛋白質(zhì)組成，DNA含量極低，導(dǎo)致DNA提取與純化困難，從而使得毛干這種極易取得的生物樣品在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域得不到有效利用[19]。根據(jù)文獻(xiàn)報道[20-22]，毛干DNA提取的主要方法包括經(jīng)典的酚-氯仿抽提法、Chelex-100法、試劑盒法以及多種組合方法。本研究對3種動物毛囊及毛干基因組DNA提取方法進(jìn)行了比較。發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的方法2效果最好，該方法使用SDS-二硫蘇糖醇DTT-蛋白酶K結(jié)合Chelex-100法提取DNA，并利用硅珠純化DNA[23]。其DNA提取過程中使用的SDS堿裂解液中加入的二硫蘇糖醇DTT及蛋白酶K能有效的將毛干全部裂解，Chelex-100是一種由苯乙烯、二乙烯苯共聚體組成的化學(xué)螯合樹脂[24]，可螯合多價離子，特別是對高價金屬離子有很高的親和力和螯合作用。在低離子強(qiáng)度、堿性及煮沸的條件下，使蛋白質(zhì)變性，通過離心除去Chelex顆粒，使其結(jié)合的物質(zhì)與DNA分離。本方法采用硅珠吸附法來純化DNA，提取的核酸純度高而且省時，更重要的是避免了酚類物質(zhì)對操作人員的毒性傷害。

表3狐貍毛混合兔毛檢測結(jié)果

Table3Thetestresultsoffoxfurmixedrabbithair

兔毛混合比例/%Doping ratio of rabbit hair狐貍Ct平均值(FAM)Ct average of fox(FAM)兔Ct平均值(JOE)Ct average of rabbit(JOE)內(nèi)參Ct平均值(CY5)Ct average of internal reference(CY5)判定結(jié)果Judgment result0.022.01±0.05陰性23.50±0.17檢出狐貍源性成分0.521.47±0.12陰性26.75±0.28檢出狐貍源性成分1.022.68±0.0634.10±0.2326.04±0.19檢出狐貍源和兔性成分5.023.85±0.2529.33±0.0226.35±0.14檢出狐貍源和兔性成分10.023.72±0.0823.15±0.4524.93±0.12檢出狐貍源和兔性成分20.023.46±0.1424.54±0.6523.35±0.25檢出狐貍源和兔性成分50.024.98±0.2224.12±0.2526.15±0.16檢出狐貍源和兔性成分

表4駱駝毛混合綿羊毛檢測結(jié)果

Table4Thetestresultsofcamelwoolmixedwool

綿羊毛混合比例/%Doping ratio of sheep wool駱駝Ct平均值(FAM)Ct average of camel (FAM)綿羊Ct平均值(JOE)Ct average of sheep(JOE)內(nèi)參Ct平均值(CY5)Ct average of internal reference(CY5)判定結(jié)果Judgment result0.023.31±0.16陰性24.78±0.02檢測出駱駝源性成分0.523.20±0.08陰性24.85±0.40檢測出駱駝源性成分1.022.34±0.1230.28±0.5523.49±0.15檢測出駱駝和綿羊源性成分5.022.79±0.4529.34±0.6125.13±0.62檢測出駱駝和綿羊源性成分10.023.52±0.3426.54±0.5226.30±0.55檢測出駱駝和綿羊源性成分20.024.07±0.2723.39±0.4426.76±0.42檢測出駱駝和綿羊源性成分50.023.24±0.1825.43±0.6223.68±0.28檢測出駱駝和綿羊源性成分

表5鴨毛混合鵝毛檢測結(jié)果

Table5Thetestresultsduckfeathersmixedgoosehair

鵝毛混合比例/%Doping ratio of goose feathers鴨Ct平均值(JOE)Ct average of duck(JOE)鵝Ct平均值(FAM)Ct average of goose(FAM)內(nèi)參Ct平均值(CY5)Ct average of internal reference (CY5)判定結(jié)果Judgment result0.031.03±0.22陰性26.12±0.11檢出鴨源性成分0.531.24±0.63陰性26.33±0.18檢出鴨源性成分1.028.78±0.6633.83±0.3725.73±0.22檢出鴨和鵝源性成分5.029.21±0.4231.41±0.4126.25±0.42檢出鴨和鵝源性成分10.030.57±0.5632.35±0.8027.93±0.21檢出鴨和鵝源性成分20.029.11±0.3230.36±0.0224.88±0.56檢出鴨和鵝源性成分50.030.86±0.4430.84±0.0926.60±0.43檢出鴨和鵝源性成分

動物毛發(fā)中的DNA本身含量較低，但在動物毛發(fā)中線粒體DNA比核DNA拷貝數(shù)要高很多，大量研究報道線粒體DNA D_loop區(qū)、COI基因、Cytb基因以及16SrDNA基因在物種間變異大，具有很高物種特異性，種內(nèi)相對保守，適合于遺傳多樣性、種屬鑒定和親緣關(guān)系的研究[25-27]。本研究以線粒體16SrRNA基因?yàn)榘谢颍O(shè)計8種動物的特異性探針及通用引物，顯著提高了DNA擴(kuò)增效率及物種特異性。通過優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和條件，建立了同時對水貂、狐貍、兔、駱駝、山羊、綿羊、鴨和鵝8種動物毛纖維源性成分的特異性鑒定體系。通過特異性方法驗(yàn)證表明除以上8種動物能被檢出外，其他物種源性均未被檢出。通過梯度稀釋DNA檢測發(fā)現(xiàn)，本方法建立的8種源性動物多重實(shí)時熒光PCR檢測體系擴(kuò)增效率為90%～120%，未受到多重探針之間相互干擾的影響，而且DNA靈敏度檢測為0.01 ng。通過常見的貴重毛纖維摻雜廉價的動物毛纖維以不同比例進(jìn)行混合，模擬混合樣本檢測，結(jié)果證明本方法最低檢出限為1.0%，說明本研究所建立的多重PCR檢測方法具有很高的靈敏度。本方法針對動物毛纖維進(jìn)行物種鑒別，可以避免因采血或取活檢組織而對動物造成應(yīng)激反應(yīng)等生理傷害，尤其瀕臨滅絕的國家保護(hù)動物，為拓展動物毛纖維物種識別、分子進(jìn)化和分子標(biāo)記輔助育種、遺傳資源分子等領(lǐng)域中的應(yīng)用奠定了研究基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

通過3種DNA提取方法的比較，采用硅珠吸附法可成功的提取動物毛干及毛囊中的DNA，省時、操作簡便且提取純度高，解決了傳統(tǒng)檢測方式因原材料DNA含量低導(dǎo)致檢測繁瑣的困難。另外，本研究所建立的8種動物毛纖維源性成分鑒定的多重實(shí)時熒光PCR體系特異性強(qiáng)，DNA檢測靈敏度可達(dá)到0.010 ng·μL-1。因此，本方法可以快速、準(zhǔn)確地鑒定貂、狐貍、山羊等各種高端動物毛纖維真?zhèn)危瑫r克服了感官檢測和顯微電鏡檢測的主觀性誤差，降低了工作經(jīng)驗(yàn)的要求，為市場上毛皮的鑒定提供了有力技術(shù)支持。