表達(dá)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒env基因的重組馬立克病毒的生物學(xué)特性

周忠文，林桂芳，王好好，蘇 帥，崔治中，孫淑紅*

(1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，泰安 271018；2. 山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰安 271018；3. 山東省畜禽疫病防制工程技術(shù)研究中心，泰安 271018)

馬立克病(Marek’s disease, MD)以及禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病(reticuloendotheliosis, RE)是危害雞群重要的腫瘤病，給養(yǎng)禽業(yè)造成極大的危害。MD是由馬立克病病毒(Marek’s disease virus，MDV)引起以感染雞肝、腎等內(nèi)臟器官的腫瘤以及T淋巴細(xì)胞的大量增生為主要特征的一種高度傳染性疾病，對(duì)未經(jīng)疫苗免疫的雞群可造成極高的死亡率[1-2]。MD是目前唯一能用疫苗免疫的家禽腫瘤病，疫苗的使用有效預(yù)防了MD的暴發(fā)。隨著疫苗的使用，病毒毒力呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢(shì)，由弱毒株、強(qiáng)毒株、超強(qiáng)毒株逐漸演變?yōu)樘爻瑥?qiáng)毒株[3-4]，MD疫苗也由最初的HPRS-16/att、火雞皰疹病毒(herpesvirus of turkeys, HVT)疫苗發(fā)展到由血清Ⅰ型MDV傳代致弱毒力的CVI988/Rispens疫苗[5-7]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外雞群MD頻發(fā)，CVI988/Rispens疫苗已經(jīng)不能提供完全的免疫保護(hù)[8-10]。Witter等[11]利用細(xì)胞傳代致弱MDV毒力的方法制備了近10株MD疫苗候選株，其免疫保護(hù)效果均沒(méi)有CVI988/Rispens好。

GX0101是從國(guó)內(nèi)免疫CVI988/Rispens疫苗發(fā)生MD腫瘤的雞群分離的MDV超強(qiáng)毒株[12]。利用細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome, BAC)技術(shù)，筆者實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了GX0101的感染性克隆bac-GX0101[13-14]，基于Red E/T同源重組技術(shù)，敲除bac-GX0101的meq基因構(gòu)建了MDV SC9-1[15]。SC9-1對(duì)雞完全喪失致病性，不再誘發(fā)接種雞產(chǎn)生腫瘤，無(wú)論是SPF雞還是海蘭褐雞SC9-1均能誘導(dǎo)比商品化疫苗CVI988/Rispens更好的免疫保護(hù)效果。

RE是由禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(reticuloendotheliosis virus, REV)引起的禽類病理綜合征，表現(xiàn)為從亞臨床感染到明顯的生長(zhǎng)遲緩、免疫抑制和腫瘤等不同的臨床和病理變化。研究表明，REV能引起接種雞早期嚴(yán)重的免疫抑制，可持續(xù)性地抑制雞對(duì)滅活疫苗的抗體反應(yīng)[16]。近年來(lái)，大量的研究顯示國(guó)內(nèi)雞群普遍存在REV流行，嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展，對(duì)于REV的免疫防控越來(lái)越引起人們的重視[17]。

本研究以前期構(gòu)建的血清Ⅰ型MDVmeq基因缺失株SC9-1為載體，利用同源重組技術(shù)將REVenv基因插入SC9-1的meq基因位點(diǎn)，構(gòu)建重組MDV，并對(duì)重組MDV的生物學(xué)特性進(jìn)行了初步研究，為其他重組MDV的構(gòu)建提供思路，也為REV的免疫防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α和DH10B由本實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM、Opti-MEM、轉(zhuǎn)染試劑LipfactamineTM2000及真核表達(dá)載體pcDNA3.1購(gòu)自Invitrogen公司。Red/ET重組系統(tǒng)Counter-Selection BAC Modification Kit購(gòu)自德國(guó)Gene Bridge公司。FITC標(biāo)記的抗鼠IgG二抗購(gòu)自Sigma公司。plasmid Maxi kit購(gòu)自QIAGEN公司。MDV 1型毒株pp38基因特異性的單克隆抗體H19、REVenv基因特異性的單克隆抗體11B118均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 SPF雞和MDV毒株 9～10日齡SPF雞胚和SPF雞均購(gòu)自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司，MDV SC9-1株[15]、MDV rMd5株[18]以及REV SNV株[19]均由本實(shí)驗(yàn)室保存。H9禽流感、新城疫二聯(lián)滅活苗購(gòu)自青島易邦生物工程有限公司(批號(hào)：161880701)。

1.2 方法

1.2.1 REVenv基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 構(gòu)建策略見(jiàn)圖1。按常規(guī)方法提取REV SNV株的感染性克隆DNA作為模板，利用Env-F/R引物擴(kuò)增env基因(表1)，回收的PCR產(chǎn)物與真核表達(dá)載體pcDNA3.1 (+) 質(zhì)粒共同用Hind Ⅲ與XbaⅠ雙酶切后進(jìn)行連接，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定的陽(yáng)性克隆命名為pcDNA-env(圖1)。使用QIAGEN plasmid Midi kit試劑盒提取并純化質(zhì)粒pcDNA-env，按照轉(zhuǎn)染試劑LipfectamineTM2000的說(shuō)明書將pcDNA-env轉(zhuǎn)染進(jìn)CEF中。轉(zhuǎn)染后放置在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h后，吸出孔中的細(xì)胞培養(yǎng)液，倒掉，用預(yù)冷的丙酮∶乙醇(體積比3∶2)固定液固定10 min，用PBS清洗1次，加入0.5 mL (1∶100稀釋)REV單抗11B118，放置在37 ℃ 生化恒溫箱中反應(yīng)1 h，用PBS清洗3次，將水分甩干，加入0.5 mL FITC標(biāo)記的抗鼠IgG熒光抗體，放置在37 ℃生化恒溫箱反應(yīng)1 h，用PBS洗3次， 在倒置熒光顯微鏡下觀察。

圖1 SC9-env BAC構(gòu)建過(guò)程示意圖Fig.1 Construction of SC9-env BAC

1.2.2 REVenv基因表達(dá)盒以及kana抗性基因克隆進(jìn)pUC18載體 以質(zhì)粒pKD13為模板，Kana-F/R引物(表1)經(jīng)PCR擴(kuò)增卡那霉素抗性基因(kanamycin resistance gene, kanr)，回收PCR產(chǎn)物，經(jīng)KpnⅠ、EcoRⅠ雙酶切后，克隆進(jìn)pUC18載體，構(gòu)建pUC18-kana重組質(zhì)粒。以pcDNA-env質(zhì)粒為模板，Biao-F/R引物(表1)經(jīng)PCR擴(kuò)增REVenv基因的完整真核表達(dá)盒，回收PCR產(chǎn)物，經(jīng)KpnⅠ、XhoⅠ雙酶切后，克隆進(jìn)pUC18-kana載體，構(gòu)建pUC18-env-kana重組質(zhì)粒。按照上述方法鑒定pUC18-env-kana重組質(zhì)粒中REVenv基因在CEF細(xì)胞中的真核表達(dá)。

表1PCR擴(kuò)增引物表

Table1PrimersforPCRamplification

引物Primer序列(5'→3') Sequence目的基因Target geneEnv-FEnv-RagcAAGCTTGAAatggactgtctcaccaacgccTCTAGAtcattgacctagggtatccatc擴(kuò)增長(zhǎng)1 782 bp含Hind Ⅲ、XbaⅠ酶切位點(diǎn)的REV env基因Biao-FBiao-RgcgGGTACCGTTGACATTGATTATTGACataCTCGAGCCATAGAGCCCACCGCATC擴(kuò)增長(zhǎng)2 728 bp含KpnⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)的REV env基因表達(dá)盒Kana-FKana-RattaGGTACCCTCGAGattccggggatccgtcgacaggaGAATTCgtgtaggctggagctgcttc擴(kuò)增長(zhǎng)1 330 bp含KpnⅠ、XhoⅠ、EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的kana基因Recombine-FTcagggtctcccgtcacctggaaaccaccagaccgtagactgagtatccgGTTGACATTGATTATTGACTAG擴(kuò)增長(zhǎng)4 120 bp含meq基因兩側(cè)同源臂的env基因表達(dá)盒以及kana基因Recombine-RatgtctcaggagccagagccgggcgctatgccctacagtcccgctgacgaGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCJC-FJC-RTAATGCCTTTAACCCTTTCAGTCAAACCGCTATCCAC擴(kuò)增長(zhǎng)605 bp嵌合基因(部分SC9-1基因以及部分env基因表達(dá)盒)

1.2.3 將REVenv基因表達(dá)盒以及kana抗性基因插入MDV SC9-1基因組meq基因位點(diǎn) 以pUC18-env-kana重組質(zhì)粒為模板，Recombine-F/R引物(表1)經(jīng)PCR擴(kuò)增包含meq基因插入位點(diǎn)前后50 bp序列同源臂的REVenv基因表達(dá)盒以及kana抗性基因，利用同源重組技術(shù)插入MDV SC9-1基因組meq基因位點(diǎn)[20]。PCR產(chǎn)物用DpnⅠ酶消化1 h，在2 000 V/100 Ω/25 μF的條件下，利用電轉(zhuǎn)化儀將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)已含有SC9-1-BAC的大腸桿菌EL250中，轉(zhuǎn)化后的菌涂于含有卡那霉素抗性的LB平板中。16 h后挑取單菌落利用JC-F/R引物經(jīng)PCR鑒定REVenv基因表達(dá)盒以及kana抗性基因是否插入MDV SC9-1基因組meq基因位點(diǎn)。鑒定陽(yáng)性菌落，用0.1%的阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)flp重組酶，通過(guò)位點(diǎn)特異性重組將kanr去除，命名為SC9-env BAC(圖1)。

1.2.4 SC9-env 重組病毒的拯救以及在CEF細(xì)胞上的增殖 利用QIAGEN plasmid Midi kit試劑盒提取并純化質(zhì)粒SC9-env BAC。以LipfectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后4～6 d，待出現(xiàn)病毒蝕斑后，分別以MDV單抗H19以及REV 單抗11B118進(jìn)行間接免疫熒光鑒定。收獲陽(yáng)性重組病毒，用0.25%胰酶消化含有重組病毒的細(xì)胞，用凍存液重懸細(xì)胞后將其凍存于液氮中，重組病毒命名為SC9-env。為了比較SC9-1與SC9-env在CEF細(xì)胞上的復(fù)制能力，將SC9-1與SC9-env按100 PFU·孔-1的劑量分別接種長(zhǎng)滿單層CEF細(xì)胞的6孔板中，放置在含有5%CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別在接種后0、24、48、72、96、120、144 h計(jì)算MDV蝕斑數(shù)。繪制MDV的生長(zhǎng)曲線，比較SC9-1與SC9-env在CEF細(xì)胞上復(fù)制水平的差異。

1.2.5 重組病毒SC9-env 對(duì)SPF雞的致病性 將75只1日齡SPF雞隨機(jī)分為3組(每組25只)，分別飼養(yǎng)在正壓過(guò)濾空氣的消毒隔離罩內(nèi)，飼料、飲用水均經(jīng)過(guò)高壓滅菌后分別飼喂。第1、2組雞分別以2 000 PFU·只-1的劑量腹腔接種SC9-env、SC9-1，第3組雞作為空白對(duì)照組。分別在接種MDV后7、14、21、28 d稱量各組雞的體重，評(píng)價(jià)SC9-1、SC9-env對(duì)SPF雞生長(zhǎng)性能的影響。接種后每天觀察各組雞的臨床癥狀并記錄雞的死亡數(shù)。試驗(yàn)期間，對(duì)各組死亡雞進(jìn)行剖檢，并取有病變的臟器做石蠟切片，HE染色后進(jìn)行病理組織學(xué)觀察，判定是否由MDV引起的死亡。在接種MDV 90 d后，所有存活雞均采用CO2安樂(lè)死并剖檢，觀察記錄雞的病變。

1.2.6 重組病毒SC9-env對(duì)SPF雞的免疫保護(hù) 為了比較SC9-env 對(duì)SPF雞感染vv MDV rMd5 的免疫保護(hù)效果。將100只1日齡SPF 雞，隨機(jī)分為4組(每組25只)，第1、2組雞分別以2 000 PFU·只-1的劑量腹腔接種SC9-env、SC9-1，第3、4組分別作為攻毒對(duì)照組、空白對(duì)照組。免疫5 d后，第1、2、3組分別以1 000 PFU·只-1的劑量腹腔接種vv MDV rMd5。攻毒后每天觀察各組雞的臨床癥狀并記錄雞的死亡數(shù)。飼養(yǎng)90 d后，所有存活雞均采用CO2安樂(lè)死并剖檢觀察其病變。選取病變的組織、臟器，并且每組隨機(jī)選取3只分別取其心、腎、肝做石蠟切片，HE染色，進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。疫苗免疫保護(hù)效力由保護(hù)指數(shù)(protective index, PI)來(lái)評(píng)價(jià)，免疫組PI計(jì)算方法:

為了比較SC9-env對(duì)SPF雞感染REV SNV 的免疫保護(hù)效果。將100只1日齡SPF 雞，按照上述試驗(yàn)方式進(jìn)行分組、免疫。免疫14 d后，第1、2、3組分別以2 000 TCID50·只-1的劑量腹腔接種REV SNV。SNV接種后14 d，各組雞均免疫NDV、AIV H9滅活苗。分別在接種SNV后7、14、21、28 d稱量各組雞的體重，攻毒后每天觀察各組雞的臨床癥狀并記錄雞的死亡數(shù)。飼養(yǎng)70 d后，所有存活雞均采用CO2安樂(lè)死并剖檢觀察其病變。

2 結(jié) 果

2.1 REV env基因的真核表達(dá)重組質(zhì)粒的鑒定

利用PCR擴(kuò)增長(zhǎng)1 782 bp的REVenv基因，克隆進(jìn)pcDNA3.1 (+)載體，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA-env轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞，以REV單抗11B118進(jìn)行IFA鑒定，發(fā)出亮綠色熒光。將pcDNA-env的env基因表達(dá)盒與卡那霉素抗性基因串聯(lián)克隆進(jìn)pUC18載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC18-env-kana。將pUC18-env-kana質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞，以REV單抗11B118進(jìn)行IFA鑒定，發(fā)出亮綠色熒光(圖2A，黑白圖中未能體現(xiàn)，下同)；pUC18-kana質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞以及空白CEF細(xì)胞以REV單抗11B118進(jìn)行IFA鑒定，均沒(méi)有發(fā)出亮綠色熒光(圖2B、C)；證實(shí)pUC18-env-kana質(zhì)粒在CEF細(xì)胞能夠表達(dá)REVenv基因。

2.2 重組MDV SC9-env的拯救及鑒定

利用同源重組技術(shù)將REVenv基因表達(dá)盒插入SC9-1基因組的meq基因位點(diǎn)，構(gòu)建了 SC9-env BAC，轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞7 d后出現(xiàn)典型的MDV蝕斑(圖3A)，以MDV單抗H19、REV單抗11B118進(jìn)行IFA鑒定，蝕斑均能發(fā)出亮綠色熒光(圖3C、D)，重組MDV命名為SC9-env；而SC9-1蝕斑僅能與MDV單抗H19發(fā)生反應(yīng)，發(fā)出亮綠色熒光(圖3E、F)；空白CEF細(xì)胞沒(méi)有亮綠色熒光(圖3G、H)。結(jié)果表明，SC9-env能夠表達(dá)REV env蛋白。

2.3 重組MDV SC9-env在CEF細(xì)胞的復(fù)制水平

將SC9-env與SC9-1分別感染CEF細(xì)胞進(jìn)行病毒復(fù)制動(dòng)態(tài)測(cè)定，結(jié)果顯示：在病毒感染后的24、48、72、96、120、144 h，SC9-env可在CEF細(xì)胞良好的復(fù)制，與SC9-1相比，SC9-env在CEF細(xì)胞的復(fù)制減慢，但是差異不顯著(圖4)。

2.4 重組MDV SC9-env對(duì)SPF雞的致病性

SC9-env接種組雞個(gè)體大小均一，生長(zhǎng)良好，沒(méi)有MD特有的臨床癥狀，體重與SC9-1組以及空白對(duì)照組雞相比差異不顯著(表2)。整個(gè)試驗(yàn)期間，SC9-env接種組雞沒(méi)有出現(xiàn)雞只死亡，存活率100%，剖檢所有雞，均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)MDV引起的腫瘤。SC9-1組與空白對(duì)照組雞同樣沒(méi)有出現(xiàn)雞死亡以及MDV誘發(fā)的腫瘤(表3)。結(jié)果表明，SC9-env對(duì)SPF雞沒(méi)有明顯的致病性以及致腫瘤性，對(duì)接種雞的體重沒(méi)有顯著影響。

A. MDV SC9-env形成的蝕斑；B. 空白CEF細(xì)胞；C. SC9-env蝕斑H19單抗IFA鑒定；D. SC9-env蝕斑11B118單抗IFA鑒定；E. SC9-1蝕斑H19單抗IFA鑒定；F. SC9-1蝕斑11B118單抗IFA鑒定；G. 空白CEF細(xì)胞H19單抗IFA鑒定；H.空白CEF細(xì)胞11B118單抗IFA鑒定A. Plaque formed by MDV SC9-env; B. Blank CEF cells; C. IFA analysis of SC9-env plaque by H19 monoclonal antibody; D. IFA analysis of SC9-env plaque by 11B118 monoclonal antibody; E. IFA analysis of SC9-1 plaque by H19 monoclonal antibody; F. IFA analysis of SC9-1 plaque by 11B118 monoclonal antibody; G. IFA analysis of blank CEF cells by H19 monoclonal antibody; H. IFA analysis of blank CEF cells by 11B118 monoclonal antibody圖3 重組MDV SC9-env的拯救及IFA鑒定(100×)Fig.3 Rescue and IFA identification of recombinant MDV SC9-env (100×)

圖4 SC9-env在CEF細(xì)胞上的復(fù)制曲線Fig.4 Replication kinetics of SC9-env in CEF cells

2.5 重組病毒SC9-env 對(duì)SPF雞的免疫保護(hù)

SC9-env 對(duì)SPF雞感染vv MDV rMd5的免疫保護(hù)效果。與空白對(duì)照組相比，rMd5攻毒對(duì)照組雞群個(gè)體明顯偏小，大小不均，雞出現(xiàn)明顯的癱瘓癥狀，攻毒后2周雞陸續(xù)出現(xiàn)死亡(圖5)。SC9-env免疫攻毒組、SC9-1免疫攻毒組雞長(zhǎng)勢(shì)正常，沒(méi)有出現(xiàn)MD臨床癥狀。試驗(yàn)期間，SC9-env免疫攻毒組有2只雞死亡，SC9-1免疫攻毒組有1只雞死亡，剖檢，均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的腫瘤結(jié)節(jié)，心、肝組織病理切片可見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖6A、B、E、F)；rMd5攻毒對(duì)照組有23只雞死亡，其中6只雞出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的腫瘤結(jié)節(jié)，心、肝組織病理切片可見(jiàn)腫瘤淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞被腫瘤細(xì)胞取代(圖6C、G)。rMd5攻毒后90 d剖檢所有存活雞，空白對(duì)照組、SC9-env免疫攻毒組以及SC9-1免疫攻毒組雞正常，沒(méi)有出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的腫瘤結(jié)節(jié)；rMd5攻毒對(duì)照組有1只雞肝出現(xiàn)明顯的腫瘤結(jié)節(jié)?；诠ザ緦?duì)照組vv MDV rMd5引起感染雞的病變率，SC9-env對(duì)SPF雞能夠提供92%的免疫保護(hù)，SC9-1對(duì)SPF雞能夠提供96%的免疫保護(hù)(表3，圖5)。

毒株Strain7日齡7 days of age14日齡14 days of age21日齡21 days of age28日齡28 days of ageSC9-env66.4±6.2a112.5±14.2a187.3±19.1a278.6±28.5aSC9-167.2±5.5a114.0±12.2a185.2±17.8a273.5±32.0aControl68.8±4.4a118.0±10.7a192.6±15.4a285.8±28.2a

同一字母表示數(shù)據(jù)差異不顯著(P>0.05)

The same letters indicate the differences of the data were not significant (P>0.05)

表3SC9-env對(duì)SPF雞的致病性及免疫保護(hù)效果

Table3PathogenicityandimmuneprotectiveefficacyofSC9-envonSPFchickens

毒株Virus攻毒Challenged死亡率/%Mortality病變率/%Lesion rate免疫保護(hù)指數(shù)/% PIαSC9-envrMd58(2/25)8(2/25)92SC9-1rMd54(1/25)4(1/25)96—rMd592(23/25)100(25/25)———0(0/25)0(0/25)—SC9-env—0(0/25)0(0/25)—SC9-1—0(0/25)0(0/25)—

α表示兩組間免疫保護(hù)指數(shù)(PI)無(wú)顯著差異(P>0.05)

PI=protection index.α.Indicates no significant difference (P>0.05) in PI among the two experimental groups

SC9-env對(duì)SPF雞感染REV SNV的免疫保護(hù)效果。整個(gè)試驗(yàn)周期，各組雞均沒(méi)有出現(xiàn)死亡，剖檢均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)肉眼所見(jiàn)的腫瘤結(jié)節(jié)。與空白對(duì)照組相比，除SC9-env+SNV組攻毒后7 d外，各SNV攻毒組體重均顯著降低(P<0.05)(表4)。SC9-env免疫攻毒組雞的體重在7、14、21、28 d 均顯著高于SNV攻毒組以及SC9-1免疫攻毒組(P<0.05)。SC9-env免疫攻毒組雞的NDV、AIV H9抗體水平均顯著高于SNV攻毒組以及SC9-1免疫攻毒組(P<0.05)(圖7)。

圖5 疫苗免疫后接種MDV rMd5各組雞的生存曲線Fig.5 Survival curves of chickens challenged with MDV rMd5 after immunization

圖6 心、肝病理組織切片圖(HE，205×)Fig.6 Pathologic section of heart and liver (HE，205×)

毒株Virus攻毒后7 d7 dpi攻毒后14 d14 dpi攻毒后21 d21 dpi攻毒后28 d28 dpiSC9-env+SNV271.1±29.1a353.8±62.5b487.2±76.0b543.6±53.1bSC9-1+SNV254.6±26.1b297.1±60.3c407.7±68.9c511.9±73.7cSNV251.0±20.3b305.4±47.2c420.4±54.5c504.3±69.1cControl282.3±34.5a383.2±44.9a536.9±59.6a613.9±72.2a

同一字母表示數(shù)據(jù)差異不顯著(P>0.05)；不同字母表示數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)

The same letters indicate the differences of the data were not significant (P>0.05), the different letters indicate the differences of the data were significant (P<0.05)

同一字母表示數(shù)據(jù)差異不顯著(P>0.05)；不同字母表示數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)The same letters indicate the differences of the data were not significant (P>0.05), the different letters indicate the differences of the data were significant (P<0.05)圖7 接種REV SNV各組雞AIV H9、NDV抗體水平Fig.7 The antibody levels induced by AIV H9 and NDV inactivated vaccines in chickens challenged with REV SNV

3 討 論

MDV分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三個(gè)血清型，其中血清Ⅰ型為致病型，近年來(lái)MDV毒力不斷增強(qiáng)[21]。Lee等[22-23]利用黏粒系統(tǒng)構(gòu)建了MDV Md5的meq基因缺失株rMd5Δmeq，比MD商品疫苗CVI988/Rispens具有更好的免疫保護(hù)效果。本實(shí)驗(yàn)室利用BAC技術(shù)構(gòu)建的MDVmeq基因缺失株SC9-1，不但對(duì)雞群的免疫保護(hù)效果優(yōu)于CVI988/Rispens，而且具有良好的生物安全性。MDV載體疫苗具有抗母源抗體干擾、免疫持續(xù)期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，一直是人們研究的熱點(diǎn)。以血清Ⅲ型MD疫苗HVT作為載體，構(gòu)建的重組MDV能夠穩(wěn)定地表達(dá)NDV、AIV、IBDV等外源病毒基因，并且對(duì)雞群ND、AI、IBD以及MD具有一定的免疫保護(hù)[24-26]。隨著MDV超強(qiáng)毒株、特超強(qiáng)毒株的出現(xiàn)，HVT疫苗對(duì)雞群MD已經(jīng)不能提供理想的免疫保護(hù)。以血清Ⅰ型MDV CVI988/Rispens、814株構(gòu)建的重組MDV對(duì)雞群ND、IB、IBD以及MD均具有良好的免疫保護(hù)[27-29]。

前期的研究已經(jīng)證實(shí)我國(guó)雞群普遍存在REV的感染，雖然REV感染雞群的致死率較低，但是REV引起的免疫抑制較強(qiáng)，尤其可顯著抑制對(duì)NDV、AIV滅活疫苗免疫后的抗體反應(yīng)，繼發(fā)的細(xì)菌感染更是增加了對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的危害[17]。迄今為止，國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有用于預(yù)防REV感染的疫苗，研究發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的REVgp90基因真核表達(dá)質(zhì)粒及其蛋白對(duì)于預(yù)防雞群REV的感染均具有良好的免疫效果[30-31]?；诒緦?shí)驗(yàn)室構(gòu)建的免疫效果比CVI988/Rispens更好的MD疫苗候選株SC9-1，利用Red E/T同源重組技術(shù)將REVenv基因表達(dá)盒插入SC9-1基因組的meq基因位點(diǎn)，構(gòu)建了重組MDV SC9-env。利用REV單抗11B118作為一抗經(jīng)IFA鑒定，SC9-env在CEF細(xì)胞穩(wěn)定的表達(dá)REV的env蛋白，表明SC9-1的meq位點(diǎn)能夠插入外源基因并且穩(wěn)定表達(dá)。病毒在CEF細(xì)胞的增殖試驗(yàn)顯示SC9-env與SC9-1在細(xì)胞上的復(fù)制水平相似，表明REVenv基因的插入沒(méi)有顯著影響重組MDV的復(fù)制。1日齡SPF雞接種SC9-env，雞群沒(méi)有死亡以及腫瘤的發(fā)生，體重與空白對(duì)照組相比差異不顯著，表明SC9-env對(duì)SPF雞沒(méi)有明顯的致病性。動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明SC9-1對(duì)感染MDV rMd5的SPF雞提供96%的免疫保護(hù)；SC9-env提供92%的免疫保護(hù)，差異不顯著，證實(shí)SC9-env對(duì)于MDV rMd5能夠提供良好的免疫保護(hù)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明SC9-1對(duì)于MDV rMd5提供92%～100%的免疫保護(hù)，而CVI988/Rispens提供60%～70%的免疫保護(hù)。雖然試驗(yàn)不是同時(shí)進(jìn)行，但是SC9-1的免疫效果相似，因此可以推測(cè)SC9-env能夠提供比CVI988/Rispens更好的免疫效果，然而這一推測(cè)尚需要試驗(yàn)驗(yàn)證。相比空白對(duì)照組雞，感染REV SNV的SPF雞呈現(xiàn)較強(qiáng)的免疫抑制，雞的體重以及免疫AIV、NDV滅活苗誘導(dǎo)的抗體水平均顯著下降，而SC9-env免疫組雞的體重以及免疫AIV、NDV滅活苗誘導(dǎo)的抗體水平均顯著高于SNV攻毒組，證實(shí)SC9-env能夠降低SNV感染SPF雞引起的體重減輕以及滅活苗抗體水平的下降。

總之，MDV疫苗候選株SC9-1作為病毒載體能夠穩(wěn)定表達(dá)外源基因，構(gòu)建的重組MDV SC9-env對(duì)SPF雞沒(méi)有明顯的致病性，對(duì)SPF雞感染MDV、REV均具有良好的免疫保護(hù)效果。然而，SC9-env作為免疫防控REV感染的重組MDV載體疫苗，其生物安全性尤其是轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)尚需進(jìn)一步全面系統(tǒng)研究。SC9-env作為疫苗候選株不同免疫方式、不同免疫劑量以及對(duì)不同靶動(dòng)物(海蘭褐、海蘭白等品系雞)的免疫效力，同樣需要大規(guī)模的田間試驗(yàn)進(jìn)行比較分析。

4 結(jié) 論

利用同源重組技術(shù)構(gòu)建的表達(dá)禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒env基因的重組馬立克病毒 SC9-env能夠穩(wěn)定復(fù)制，對(duì)感染馬立克病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒的SPF雞具有良好的免疫保護(hù)效果，為雞群馬立克病、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病的免疫防控奠定基礎(chǔ)。