甘南藏區(qū)牦牛隱性乳房炎病原菌分離及鑒定

王 斐 ，王彩蓮 ，郎 俠 ，宋淑珍 ，楊 峰 ，吳建平

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所，蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050；3.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，蘭州 730070）

牦牛（yak）分野生牦牛（Bosmutus）和馴養(yǎng)牦牛（Bos grunniens），是以我國青藏高原為中心分布的特有牛種之一。其中，馴養(yǎng)牦牛作為一種全能家畜，其肉、乳、毛、糞及役力都是當(dāng)?shù)啬撩竦纳a(chǎn)必需品和重要的生活及經(jīng)濟來源。據(jù)統(tǒng)計，甘肅省甘南藏族自治州牦牛共存欄138萬頭，產(chǎn)奶量高達11.5萬t；但由于牦牛飼養(yǎng)分散、大多數(shù)牦牛乳為牧民家庭自留用于制作奶茶、酥油、酸奶等食品，商品率較低，商品乳產(chǎn)量僅約2萬t［1-2］。

2017年7月，在中國牦牛乳產(chǎn)業(yè)發(fā)展論壇暨“中國牦牛乳都”授牌儀式上，甘肅省甘南州被中國乳制品工業(yè)協(xié)會授予“中國牦牛乳都”榮譽稱號，“甘南牦牛奶粉”被認證為地理標志保護產(chǎn)品［3］，這意味著牦牛乳業(yè)將成為壯大甘南特色產(chǎn)業(yè)規(guī)模、助推藏區(qū)經(jīng)濟轉(zhuǎn)型跨越發(fā)展的新引擎。但由于藏區(qū)條件所限，牦牛擠奶時仍采用最原始的人工擠奶，擠奶方式粗放，易造成乳房的機械性損傷；同時，擠奶人員對環(huán)境、個人、乳房清潔與消毒的忽視，極有可能造成乳房炎在牦牛群中的擴散和二次感染，嚴重威脅牦牛及牧民的健康與安全。

近年來，國內(nèi)研究人員分別對西藏自治區(qū)林周縣［4］、青海省瑪沁縣［5］與烏蘭縣［6］及四川省紅原縣［7］牦牛隱性乳房炎的感染情況進行了調(diào)查研究，并分離鑒定了相關(guān)病原菌。但尚未有針對甘肅省甘南州牦牛隱性乳房炎發(fā)病情況及病原菌的相關(guān)調(diào)查研究。本研究采集甘肅省甘南州瑪曲縣、夏河縣不同牧場的乳樣，從LMT非陰性的乳樣中分離純化細菌，通過16S rDNA方法對細菌的種屬進行鑒定，以期為甘南州牦牛隱性乳房炎的預(yù)防和治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 PCR擴增儀（SEDIG Thermo Cycler）、電泳儀（GES）為美國威泰克（Wealtec）公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)（Quantum ST5）為法國維樂貝爾（Vilber）公司產(chǎn)品；離心機（5805DL865663）為德國艾本德（Eppendorf）公司產(chǎn)品；超凈工作臺（SW-CJ-2FD）為蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；高壓蒸汽滅菌器（XFS-280MB）為浙江新豐醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱（SPX-0850）為杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；冰箱（BCD-215SNGN）為青島海爾股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 試劑 蘭州奶牛隱性乳房炎診斷液（LMT）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所提供；營養(yǎng)肉湯、血瓊脂營養(yǎng)基礎(chǔ)、營養(yǎng)肉湯瓊脂、水解酪蛋白瓊脂及哥倫比亞血平板為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；細菌DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.Bacterial DNA Kit）為美國歐米伽（Omega Bio-Tek）公司產(chǎn)品；16S rDNA PCR試劑盒（DNA Marker DL1000）為日本寶日醫(yī)（TaKaRa）公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 LMT檢測及樣本采集 于甘南藏族自治州瑪曲縣、夏河縣夏季牧場內(nèi)，對無臨床乳房炎癥狀牦牛進行LMT檢測。采集前，酒精棉消毒乳頭，棄去頭兩把乳汁，取每頭牦牛不同乳區(qū)的4份乳樣，分別加入LMT檢驗盤內(nèi)，取樣多于2 mL，并傾斜檢驗盤約60°，使多余乳樣流出；取LMT檢驗液加入檢驗盤內(nèi)，每區(qū)2 mL；逆時針晃動檢驗盤，使待檢乳汁與檢驗液混合均勻，20～30 s后觀察是否有膠性凝集物。檢出結(jié)果為非陰性的乳樣冷藏保存，并盡快進行細菌分離培養(yǎng)。

1.2.2 細菌分離純化 將乳樣混合均勻，挑取適量劃線接種于血平板上，37℃恒溫孵育18～20 h；挑取血平板上的單個菌落分別接種于營養(yǎng)肉湯中，37℃恒溫孵育18～20 h；取培養(yǎng)后的細菌進行鏡檢，若已分離純化，加入脫脂乳中冷凍保存；若未純化，則繼續(xù)劃線接種于血平板，重新進行分離純化，待確定已分離純化后冷凍保存。

1.2.3 細菌鑒定 采用16S rDNA鑒定方法。使用細菌DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.Bacterial DNA Kit）提取細菌DNA，操作按試劑盒說明書進行；以提取出的細菌DNA作為模板，使用16S rDNA PCR試劑盒對其進行PCR擴增，操作按試劑盒說明書進行；擴增產(chǎn)物進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，并利用凝膠成像系統(tǒng)進行觀察分析；將符合測序標準的PCR產(chǎn)物純化，送北京六合華大基因科技股份有限公司測序；利用NCBI數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)片段比對搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool，BLAST）搜索比對測序所得片段，確定細菌種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳樣采集及LMT檢測

分別于2015年9月、2016年7—8月在甘肅甘南藏族自治州瑪曲縣、夏河縣共檢測無臨床乳房炎癥狀牦牛乳區(qū)1 181個，分屬于11個牦牛群，最少的群9頭共36個，最多的群41頭共158個。采用LMT檢測隱性乳房炎發(fā)病情況，結(jié)果見表1。由表1可見，試驗共檢出隱性乳房炎疑似（±）49份、弱陽性（+）59份、陽性（++）13份、強陽性（+++）0份，共121份，檢出率10.25%。

表1 甘南藏區(qū)牦牛隱性乳房炎LMT診斷結(jié)果

2.2 細菌分離及鑒定

在非陰性樣品中共分離出細菌236株；使用TaKaRa PCR Kit提取16S rDNA，送北京華大公司測序，測序結(jié)果與NCBI BLAST中已發(fā)表的基因序列進行比對，鑒定細菌種屬，結(jié)果見表2。由表2可見，甘南藏區(qū)牦牛隱性乳房炎乳樣中共分離出的236株細菌屬于12屬16種細菌，以葡萄球菌屬為主，占58.90%，主要包括金黃色葡萄球菌（43.22%）、艾格尼絲葡萄球菌（7.6%）和沃氏葡萄球菌（5.50%）；其次為乳球菌屬（20.34%）和埃希氏菌屬（13.14%）。

表2 甘南藏區(qū)牦牛隱性奶牛乳房炎病原菌分離鑒定結(jié)果

3 討論

牦牛作為青藏高原地區(qū)特有的珍稀種質(zhì)資源之一，是高寒地區(qū)牧民重要的奶、毛、肉、役力及燃料來源。其中牦牛乳最具有經(jīng)濟價值，母牛泌乳高峰期一般為產(chǎn)犢當(dāng)年的8月，擠乳日數(shù)和產(chǎn)乳量因地區(qū)習(xí)俗不同分別為105～180 d、147.6～482.2 kg［8］。牦牛乳風(fēng)味獨特、營養(yǎng)豐富［9］，是當(dāng)?shù)啬撩袢粘Ｉ畹谋匦杵贰Ｈ欢?，為條件所限，目前牦牛奶的采集仍主要由藏家主婦操作，衛(wèi)生條件較差，管理方式粗放，同群母牛通常由同一個人連續(xù)手工擠奶等，極易造成牦牛隱性乳房炎的發(fā)生。

本研究采用LMT檢測牦牛隱性乳房炎，使用期間未發(fā)現(xiàn)唐國盛等［10］提出的在使用LMT檢測牦牛乳樣時出現(xiàn)混合物濃稠、不易晃動等問題。自1983年［11］至今，LMT廣泛用于奶牛乳房炎的檢測與發(fā)病程度的判定［11-12］。但在牦牛隱性乳房炎檢測中，近年來大部分研究采用牛乳體細胞計數(shù)（SCC）［7，14］及苛性鈉凝乳試驗法［5-6，15］，LMT 僅見于 1987—1990 年的報道之中［10，16］；封家旺等［4］曾采用與LMT原理相似的加州乳房炎試驗（CMT）對牦牛隱性乳房炎進行檢測并分離鑒定出了相關(guān)病原菌，但未提及檢出率。

甘肅省甘南州牦牛隱性乳房炎檢出率10.25%，與近年來鄰近的青海的乳區(qū)陽性檢出率11.20%、12.03%結(jié)果相似［5-6］，與四川（35.00%）差異較大［7］，這說明牦牛隱性乳房炎發(fā)病率與地區(qū)有關(guān)。而20世紀80年代末期，牦牛隱性乳房炎陽性率僅3.60%～10.00%，乳區(qū)陽性率更低，只有 1.57%～2.56%［10，17］，遠遠低于本研究結(jié)果，這可能是由于近40年來藏區(qū)原本相對潔凈、封閉的環(huán)境被打破，人工擠奶及衛(wèi)生條件較差等原因令細菌經(jīng)人—畜傳播、畜—人—畜大肆傳播，導(dǎo)致牦牛隱性乳房炎發(fā)病率大幅升高。但由于條件所限，本研究未對LMT、SCC及苛性鈉凝乳試驗結(jié)果進行對比，因此在檢出率中將疑似乳樣計算在內(nèi)，對其中分離培養(yǎng)所得病原菌也進行了純化鑒定。

通過16S rDNA測序比對，牦牛疑似及陽性乳樣中共分離出236株細菌，共12屬16種，以葡萄球菌屬（58.90%）、乳球菌屬（20.34%）和埃希氏菌屬（13.14%）為主。自1917年以來，研究者們普遍認為無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）是導(dǎo)致奶牛乳房炎發(fā)生的最重要的病原微生物［17-18］。?stensson 等［18］的研究中亦提及奶牛隱性乳房炎病原菌主要為鏈球菌屬，其次為葡萄球菌屬；同時，在李小旭等［7］和封家旺等［4］的研究中，牦牛隱性乳房炎的主要致病菌均為鏈球菌屬，分別占致病菌總數(shù)的75.00%和25.00%，包括乳房鏈球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌等，其次為葡萄球菌屬、埃希氏菌屬等。但是，奶牛臨床型與非臨床型（即隱性）乳房炎病原菌的種類及其發(fā)生頻率并不完全相同［17，19］。很多研究［20-21］顯示，在奶牛隱性乳房炎病例中，葡萄球菌屬和埃希氏菌屬的檢出率遠高于鏈球菌屬，其中以金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌為主?？紤]到周邊環(huán)境中病原菌的存在與奶牛乳房炎發(fā)病率有直接關(guān)系［21］，因此，本研究中未分離出鏈球菌屬細菌，可能與瑪曲縣、夏河縣牧場中鏈球菌分布較少有關(guān)。需進一步對此結(jié)果進行論證和研究。

乳房炎是導(dǎo)致泌乳牛產(chǎn)奶量下降最主要的原因之一，而缺乏臨床癥狀的隱性乳房炎不僅導(dǎo)致牦牛產(chǎn)奶量下降，其中攜帶的病原菌更是威脅擠奶人員及當(dāng)?shù)啬撩裆眢w健康的一大潛在危害。本研究采用LMT對牦牛隱性乳房炎進行判定，試劑和檢驗盤攜帶方便，操作過程簡單、結(jié)果直觀；同時采用16S rDNA測序比對分離鑒定病原菌，比此前研究中常采用的生化鑒定結(jié)果更為準確，基本不存在誤判的可能，為預(yù)防牦牛隱性乳房炎的發(fā)生、發(fā)展和及時的診斷治療提供了可靠的理論依據(jù)。