牛脂肪組織中miRNA的研究進展

紀 會，柴志欣，王 會，鐘金城

（西南民族大學青藏高原研究院，四川 成都 610041）

miRNA是一類長20～25個核苷酸的非編碼小RNA，一般以互補配對的方式與靶基因結合，引導RNA誘導沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC）清除mRNA或抑制mRNA的翻譯，從而影響編碼蛋白基因的表達。miRNA最先是在秀麗線蟲中被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)miRNA廣泛存在于哺乳動物、果蠅和植物等生物中。miRNA基因盡管不編碼蛋白，但其編碼的RNA在生物整個生命活動中發(fā)揮著重要作用。近年來，科學家們在有關牛miRNA的研究方面也做了大量研究，發(fā)現(xiàn)miRNA在牛的脂肪沉積與代謝，脂肪細胞生成、增殖與分化過程中起關鍵作用。本文就miRNA生物合成機制、最新研究進展及在牛脂肪代謝中的研究進行總結，以期為今后更好地發(fā)掘牛脂肪組織中miRNA的功能提供參考。

1 miRNA的合成及其作用機制

1.1 miRNA的合成

miRNA是一類由基因組DNA轉錄生成用于調控RNA的非編碼序列。miRNA生物合成過程主要分為在細胞核內和細胞質中2個階段（圖1［1］）。首先，在細胞核內RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ）的催化作用下，miRNA相關基因轉錄得到初級miRNA（pri-miRNA），此時pri-miRNA含有1個莖環(huán)，在5′端有帽狀結構，3′端包含長達幾千核苷酸（nt）的多聚腺苷酸尾狀結構。隨后內切酶Drosha（RNA聚合酶Ⅲ）與微處理復合物亞基DGCR8結合識別pri-miRNA，將pri-miRNA剪切成60～70 nt的發(fā)卡小分子RNA（即pre-miRNA前體），由輸出蛋白Exportin-5與RAN-GTP結合蛋白相互作用將pre-miRNA 轉運出細胞核［2-3］；其次，在細胞質中，premiRNA被Dicer內切酶剪切掉莖環(huán)結構后形成長19～25 nt的雙鏈RNA，小分子雙鏈RNA隨后結合到（Argonaute）AGO蛋白上形成一個復合物前體（PrimiRISC），miRNA 的過客鏈（Passenger strand）被 PrimiRISC迅速移去后降解，剩下的成熟導向鏈（guide strand）與AGO蛋白相互作用形成RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。關于兩條鏈在RISC復合物中是如何分開、如何外排，此過程目前還沒有明確解釋。

1.2 miRNA的作用機制

miRNA主要的作用機制是誘導靶mRNA降解或阻止翻譯起始，從而在轉錄后水平實現(xiàn)對靶基因的表達調控，降解靶mRNA序列。miRNA降解mRNA過程：miRNA通過5′端被稱為種子序列（Seed sequence）的7nt序列與靶基因mRNA 3′UTR（非編碼區(qū)）完全互補結合，部分功能性miRNA也可與5′UTR中開放閱讀框架結合，RNA誘導基因沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC）誘導mRNA序列poly-A尾巴脫腺苷酸化隨后脫帽［4］，使其失去穩(wěn)定性而降解，mRNA豐度減少，翻譯減少。阻止翻譯起始：如果miRNA與靶mRNA序列部分互補，通常不會導致mRNA降解［5］，而是RISC復合物定位于3′UTR，阻礙起始蛋白與mRNA 5′帽子結合，從而抑制靶mRNA翻譯起始［6］（圖1）。miRNA調控通過RISC復合物完成，AGO家族蛋白是復合物的核心元件，也是miRNA功能途徑中的關鍵蛋白，其能夠結合miRNA以及剪切靶標基因。AGO蛋白（Argonaute proteins）由 N末端、PAZ、MID和PIWI四個結構域組成，PIWI區(qū)具有切割mRNA的催化中心。通常認為，miRNA與AGO1結合組成miRNA效應器復合物（miRNARISC，miRISC）引導靶mRNA裂解或抑制翻譯，這種結合作用主要在植物和果蠅中研究發(fā)現(xiàn)［7-8］，在哺乳動物中研究較少。然而，miRNA-AGO2機制在哺乳動物中作用顯著，AGO2具有RNA酶切活性，催化miRNA切割mRNA［9］。有研究表明，AGO2介導的RNA沉默途徑與腫瘤密切相關。Chiyomaru 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，miR-141 依賴AGO2介導HOTAIR基因沉默，抑制腫瘤增殖。到目前為止，miRNA-AGO2作用機制在生物體內有許多功能不為所知，需要繼續(xù)探索、發(fā)現(xiàn)。

圖1miRNA的合成及其作用機制

2 牛脂肪組織中miRNA的相關研究進展

胴體中皮下和肌內脂肪含量是家畜肉品質評價的重要指標，因胴體肌內脂肪較皮下脂肪難沉積而導致肌內脂肪不足和皮下脂肪過多，成為高品質家畜肉質生產的難點之一。近年來，研究人員運用高通量測序技術不斷挖掘牛脂肪組織中發(fā)揮作用的miRNA并探究其功能，發(fā)現(xiàn)其中的 miR-378、miR-27b、miR-320a、miR-2400、miR-23a等發(fā)揮重要調控作用。

2.1 miR-378調控脂質代謝的研究

Jin等［11］利用qRT-PCR分析比較了不同背脂厚度雜種閹牛皮下脂肪組織中特異miRNA的表達模式，實驗共檢測到18個miRNAs的表達與背脂厚度相關，其中miR-378表達顯著。Hu等［12］通過對映射激酶介導的PPARγ磷酸化作用抑制脂肪生成的研究發(fā)現(xiàn)，816個潛在的靶基因中，其中靶基因MAPK1（蛋白激酶1）可介導脂肪形成轉錄因子PPARγ（過氧化物酶體增殖物激活受體γ）磷酸化并降低其轉錄活性。Rangwala等［13］和Rosen等［14］的研究結果表明，PPARγ在牛前脂肪細胞脂肪形成過程中表達量上調，降低PPARγ水平可顯著抑制3T3-L1細胞中前脂肪細胞向脂肪細胞的轉化［15］，推測miR-378通過靶向調控MAPK1和PPARγ來促進牛白色脂肪組織中脂肪的形成。Liu等［16］研究發(fā)現(xiàn)，在過表達miR-378的牛脂肪細胞分化過程中，脂滴體積增大，甘油三酯含量增加，說明miR-378可促進牛前體脂肪細胞分化。Kulyté等［17］研究發(fā)現(xiàn)，miR-378 過表達會導致人體脂肪細胞脂肪分解加速，而脂肪細胞脂解增強是導致癌癥惡病質的原因之一，說明miRNA-378的表達與人患癌癥有相關性。也有大量研究發(fā)現(xiàn)，miR-378在哺乳動物脂肪細胞分化過程中的調控作用至關重要，且具有保守性。

2.2 miR-27b等其他轉錄因子對脂質代謝調控作用

Gu等［18］從牛脂肪和乳腺組織中共鑒定出59個不同的miRNA。Moura等［19］通過檢測飼喂不同日糧（高或低脂肪含量）對牛皮下脂肪和內臟脂肪的影響，發(fā)現(xiàn)在高脂日糧組牛脂肪組織中檢測到的miRNA數量高于低脂日糧組牛，其中 miRNA（miR-19a，miR-92a，miR-92b，miR-101，miR-103，miR-106，miR-142-5p 和 miR-296）差異表達顯著（P＜0.05），說明這 8種 miRNAs相應靶基因可能參與飼喂高脂肪日糧誘導牛脂肪組織脂肪沉積過程。汪海洋等［20］利用miRNA微陣列芯片技術對西門塔爾牛肌內脂肪和皮下脂肪miRNA表達譜進行了檢測和分析，發(fā)現(xiàn)在差異表達極顯著的88個miRNA中，miR-27b等重要miRNA可能以其獨特通路（如MAPK信號）來調節(jié)牛肌內脂肪的形成。Romao等［21］從3個不同發(fā)育時段的8頭英國大陸雜種閹牛中獲得24個皮下脂肪組織，共檢測到224個miRNA，預測其中17個特異性miRNA可能參與調節(jié)牛脂肪組織的能量平衡。褚敏［22］利用Solexa高通量測序技術篩選冷暖兩季牦牛皮下脂肪及背最長肌miRNAs，并分析其分子代謝通路，結果共檢測到70個miRNA在2個季節(jié)皮下脂肪組織的表達量達到差異顯著水平（P＜0.05），其中miR-335、miR-378b、miR-200a、miR-200b、miR-200c 及miR-210對牦牛脂肪代謝起調控作用；皮下脂肪組織差異表達miRNA共預測到815個達到顯著水平（P＜0.05）的靶基因，主要富集在脂肪細胞生成與代謝、脂肪酸合成與分解等77個通路中。孫加節(jié)［23］通過測序篩選秦川牛胎牛期和成年期背部脂肪組織中特異性表達miRNAs，利用qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)miRNA-n25和miRNA-n26在脂肪組織中高表達，且在母牛背部脂肪組織中表達量顯著上調（P＜0.05），其靶基因與脂肪形成或脂滴沉積等過程顯著相關（P＜0.05）。郭云濤［24］利用 RNA-Seq技術對日本黑毛和牛及荷斯坦牛背部皮下脂肪組織miRNA表達情況進行了比較分析，鑒定出bta-miR-30f、bta-miR-196b和bta-miR-2887等14個上調表達miRNA，3 個下調表達 miRNA（bta-miR-320a、bta-miR-874和bta-miR-1247-3p），預測出15個新miRNA。其中在日本黑毛和牛中下調表達且豐度較高的bta-miR-320a在各物種間較保守，bta-miR-320a啟動子區(qū)域有多個轉錄因子結合位點，通過p53（抑癌基因）、細胞周期和MAPK等信號轉導通路負調控牛脂肪細胞分化，進而影響牛脂肪沉積。Wei等［25］提出，miR-2400可通過調節(jié)靶向PRDM11（轉錄抑制子）促進前脂肪細胞增殖。Long等［26］從胎牛骨骼肌中分離出血小板源性前體細胞并誘導其成為脂肪細胞。使用miRNAome測序發(fā)現(xiàn)，下調bta-miR-23a可以增加脂質積累和C/EBPα（轉錄因子 CCAAT/增強子結合蛋白 α）、PPARγ及 FABP4（脂肪酸結合蛋白4）的表達，促進牛骨骼肌中脂肪形成，說明在早期肌內脂肪細胞中bta-miR-23a作為一種抗脂肪形成調節(jié)因子發(fā)揮作用。

2.3 miRNA調控脂質代謝通路

不同研究者在皮下脂肪和肌內脂肪、不同品種牛脂肪組織間及在不同環(huán)境或不同飼養(yǎng)條件下的牛脂肪組織中篩選出大量差異表達miRNA，分析miRNA在脂肪組織中的生物學功能及調控機制，也驗證了miRNA通過特定信號轉導通路參與調節(jié)牛脂肪組織中脂肪生成，說明miRNA在牛脂肪組織中發(fā)揮重要調控作用，需要不斷研究挖掘關鍵miRNA，并且了解miRNA在牛體內的作用機制和生物學功能，才能將理論運用到實踐，指導不同牛品種的培育，獲得高品質牛肉。在信號通路研究中，MAPK信號通路對細胞周期運行和基因表達具有重要調控作用，MAPK包括多個成員，是miRNA調控基因表達的重要信號通路，活化后的MAPK成員向核內遷移，磷酸化包括轉錄因子（如PPARγ）在內的核蛋白和膜受體，實現(xiàn)miRNA對靶基因轉錄和其他事件的調節(jié)，在牛脂肪組織中MAPK與miRNA的調控網絡值得深入探究。

miRNA可以穩(wěn)定地存在于血清和血漿等多種體液中，這類miRNA稱為循環(huán)miRNA，一般以內分泌或旁分泌的形式發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪細胞間的循環(huán)miRNA可調節(jié)細胞中脂質生成和積累，且效果顯著［27］。Kahn等［28］鑒定出脂肪細胞可通過“外泌體”微小囊泡將miRNA分泌到血液中，且所分泌的miRNA有助于調節(jié)肝臟等組織器官，小鼠體內多個循環(huán)miRNA均來自脂肪組織，循環(huán)miRNA在肝臟中能夠調節(jié)基因表達。目前，對循環(huán)miRNA的生物學功能及作用機制研究較少，牛脂肪組織中相關循環(huán)miRNA尚未見報道，但可推測牛體內關鍵循環(huán)miRNA對脂肪組織細胞中脂質生成和積累均具有調節(jié)作用，比如皮下脂肪組織與肌肉組織之間是否存在特異循環(huán)miRNA參與調節(jié)還有待驗證。

3 miRNA在牛其他組織中的調控作用

對牛miRNA的研究結果顯示，miRNA除了參與調控脂肪生成代謝，對其他器官的發(fā)育也發(fā)揮著重要調控作用。研究發(fā)現(xiàn)，大量miRNA與牛乳腺發(fā)育和泌乳繁殖性狀相關。李惠俠等［29］應用miRNA基因沉默技術研究了高溫條件下miR-24對奶牛乳腺上皮細胞增殖和凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)miRNA-24對乳腺組織發(fā)育具有重要調控作用，抑制miRNA-24的表達可以緩解高溫誘導下奶牛乳腺上皮細胞凋亡發(fā)生率、促進細胞的生長發(fā)育。王杰等［30］也利用基因沉默技術，發(fā)現(xiàn)miR-152在奶牛乳腺上皮細胞中通過抑制靶基因SOCS3（細胞因子信號轉導抑制蛋白 3）的表達，調控 p-STAT5、p-mTOR、S6K1、cyclinD1信號轉導，從而促進乳蛋白合成和乳腺上皮細胞增殖。目前，對miRNA在奶牛乳腺發(fā)育中的調控研究已有大量報道，但microRNA在乳腺發(fā)育和泌乳等生物學過程中的調節(jié)作用還有待研究。此外，部分miRNA對犏牛雄性不育有重要調控作用。李彩霞等［31］通過高通量測序技術，比較分析了牦牛和犏牛睪丸組織中miRNA的數量和種類，篩選出差異顯著的10個miRNA，與牦牛相比，犏牛睪丸中有8個miRNA表達上調，2個表達下調。其中miR-34c、miR-34b和miR-355分別與性別決定、附睪及精子發(fā)生密切關系，其他7個miRNA可能在牦牛精子發(fā)生中起重要調節(jié)作用。廖珂［32］為了解miRNA在犏牛睪丸功能發(fā)揮及生殖調控過程中的作用，通過對牦牛、普通牛、犏牛睪丸組織中miRNA鑒定及生物學功能研究，發(fā)現(xiàn)睪丸組織中表達量較高的miRNA（bta-miR-125a、bta-miR-125b、bta-miR-26a、bta-miR-26b）可調控靶基因，可能與犏牛精子發(fā)生阻滯相關。牦牛與普通牛雜交，得到的后代犏牛具有顯著的雜種優(yōu)勢，產肉、產乳量均高于牦牛，但表現(xiàn)出雄性不育，雜種優(yōu)勢的利用受到極大限制，目前相關研究報道較少。

4 結語

目前，miRNA在牛脂肪組織及其他組織中的生物學調控作用方面的研究越來越多，利用高通量測序或芯片技術篩選影響牛脂肪細胞分化過程及脂代謝過程中的關鍵miRNA，利用生物信息學手段預測其靶基因并進行GO功能和KEGG通路分析，得到靶基因在脂肪細胞生成與代謝、脂肪酸合成與分解的信號通路。繼而，對牛前脂肪細胞中目標miRNA進行干擾或過表達，根據脂肪細胞分化狀態(tài)變化和脂質積聚情況驗證miRNA調控作用。高通量測序由于測序成本逐年降低和測序技術本身的優(yōu)勢如準確定量和新miRNA的鑒定等原因受到廣泛青睞。但是，在對miRNA的研究過程還存在較多疑問，在生物體中，miRNA與靶基因間的調控機制具有一定規(guī)律，但對此規(guī)律性了解得不夠透徹，miRNA對靶基因的調節(jié)通過多種組合模式構成一個復雜的調控網絡，一個miRNA分子可調控多個靶基因，而一個基因則被多個miRNA分子調控，在某些信號刺激下，從整體上調控有機體的生命活動，在沒有徹底理清這個復雜的調控網絡前，無法把miRNA功能開發(fā)運用到真正的肉牛培育上。目前已有近上萬條miRNA被鑒定，miRNA功能分析方法主要依賴GO分類法、信號通路分析和基因調控網絡分析，但均存在不足，導致絕大多數miRNA的功能尚不明確，所以開發(fā)高效的生物信息分析工具也是未來研究中急需解決的主要問題?，F(xiàn)階段處于挖掘牛新的miRNA及其功能的實驗探索時期，相信不久的將來，miRNA在調控牛生長發(fā)育、改良肉品質、調節(jié)脂肪代謝、均衡牛營養(yǎng)水平等方面的作用將有突破性進展，進而在牛肉生產中實現(xiàn)量與質的飛躍。