凍胚移植周期中培養(yǎng)液蛋白添加物濃度對(duì)臨床結(jié)局的影響

張嶺，舒靜，張琳，李施施，黃瓊曉，傅曉華，朱晶，徐維海

（浙江省人民醫(yī)院，浙江 杭州 310014）

優(yōu)質(zhì)的培養(yǎng)體系是保證體外受精-胚胎移植（IVF-ET）治療結(jié)局的一個(gè)重要因素。蛋白添加物是胚胎培養(yǎng)液中的重要成分，發(fā)揮著調(diào)節(jié)膠體滲透壓、防止胚胎粘連、中和毒素、提供營(yíng)養(yǎng)成分等重要作用[1]。目前，商品化的蛋白添加物主要有人血清白蛋白（HSA和 Buminate）和復(fù)合蛋白添加物（SSS、SPS和LGPS）[2]。在凍胚移植周期中，胚胎在解凍后會(huì)被置于適當(dāng)?shù)哪遗吲囵B(yǎng)液中，使其恢復(fù)細(xì)胞活性。不同實(shí)驗(yàn)室在囊胚培養(yǎng)液中添加的蛋白濃度存在很大差異（2.5%~50%），但具體哪個(gè)濃度更有利于臨床結(jié)局，尚無(wú)明確結(jié)論。本文采用隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)比較兩種不同濃度蛋白添加物對(duì)凍胚移植后臨床結(jié)局的影響，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以2017年6-12月在本院行凍胚移植治療的患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＜35 歲；（2）首次接受 IVF-ET 治療者；（3）移植胚胎為3日齡卵裂胚。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）存在宮腔因素（移植日子宮內(nèi)膜<7mm、宮腔粘連、子宮畸形等）；（2）夫婦任何一方存在染色體異常者；（3）隨訪依從性差或主動(dòng)要求退出研究者?；颊呋A(chǔ)情況、治療處理措施等資料均從本院輔助生殖中心病例數(shù)據(jù)庫(kù)中提取。研究已通過(guò)本院生殖倫理學(xué)委會(huì)員審查，相關(guān)研究均獲得患者夫婦的知情同意。共納入60例研究對(duì)象，電腦隨機(jī)分成高蛋白添加物組（10%SSS，簡(jiǎn)稱(chēng) “高蛋白組”）和低蛋白添加物組（5%SSS，簡(jiǎn)稱(chēng)“低蛋白組”），每組 30例。兩組在年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、抗繆勒氏管激素（AMH）、不孕類(lèi)型、授精方式、移植日子宮內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)、移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)上差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （均P＞0.05）。詳見(jiàn)表1。

1.2 方法 （1）實(shí)驗(yàn)室處理：培養(yǎng)體系采用Vitro Life G系列培養(yǎng)液（G2培養(yǎng)液），于移植前1天配制培養(yǎng)液。高蛋白組為G2+10%SSS，低蛋白組為G2+5%SSS，培養(yǎng)液表面覆蓋礦物油，于培養(yǎng)箱中平衡16小時(shí)以上。移植當(dāng)天采用玻璃化解凍方法解凍3日齡冷凍胚胎，復(fù)蘇后將胚胎置于平衡好的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí)左右，按照本中心常規(guī)操作規(guī)范進(jìn)行胚胎移植。（2）臨床處理：依據(jù)本中心臨床操作規(guī)范，凍胚移植常規(guī)采用兩種內(nèi)膜準(zhǔn)備方案，分別為激素替代周期（HRT）和自然周期（NC）。在HRT中，患者于月經(jīng)第3天（排除非經(jīng)期異常出血）口服補(bǔ)佳樂(lè)3mg（戊酸雌二醇片，拜耳醫(yī)藥）2次/d，1周。1周結(jié)束時(shí)，若血液雌二醇（E2）濃度達(dá)150pg/mL且子宮內(nèi)膜厚度達(dá)7mm（雙層）以上，則繼續(xù)服用補(bǔ)佳樂(lè)5天，然后肌肉注射黃體酮40mg以轉(zhuǎn)化內(nèi)膜，3天后行胚胎移植。如口服補(bǔ)佳樂(lè)1周后血E2或內(nèi)膜厚度未達(dá)上述標(biāo)準(zhǔn)，則在原有基礎(chǔ)上再經(jīng)陰道予半片白色芬嗎通片 （含雌二醇0.5mg，雅培制藥），5天后重新評(píng)估。在自然周期中，患者自月經(jīng)第9天起接受卵泡監(jiān)測(cè)，如排卵前內(nèi)膜厚度＞7mm且血E2＞150pg/mL，于排卵當(dāng)日肌肉注射黃體酮40mg，3天后行胚胎移植。

表1 兩組基礎(chǔ)資料比較

1.3 觀察指標(biāo) 移植后第14天查血、尿人絨毛膜促性腺激素（hCG），若hCG陽(yáng)性，則于移植后4周行超聲檢查，若超聲檢查見(jiàn)孕囊則判定為臨床妊娠，若未見(jiàn)孕囊則判定為生化妊娠。此后，隨訪至移植后8周并記錄妊娠狀態(tài)，包括流產(chǎn)（8周時(shí)胎體已丟失）、繼續(xù)妊娠（移植后8周時(shí)胎體仍健在）、異位妊娠（胎體位于子宮外器官中）和妊娠胎數(shù)。最后，計(jì)算胚胎著床率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、繼續(xù)妊娠率和多胎率 （妊娠胎數(shù)≥2個(gè)）。各計(jì)算公式如下：胚胎著床率=妊娠胎數(shù)／移植胚胎數(shù)×100%；臨床妊娠率=妊娠例數(shù)/移植例數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)例數(shù)/臨床妊娠例數(shù)×100%；多胎率=多胎例數(shù)/臨床妊娠例數(shù)×100%；繼續(xù)妊娠率=繼續(xù)妊娠例數(shù)/移植例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或校正χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

移植后隨訪數(shù)據(jù)顯示，兩組hCG陽(yáng)性率、生化妊娠、臨床妊娠、流產(chǎn)、繼續(xù)妊娠、胚胎著床、多胎數(shù)和異位妊娠指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），詳見(jiàn)表2。

表2 兩組胚胎移植妊娠結(jié)局[n（%）]

3 討論

冷凍胚胎移植是IVF-ET技術(shù)中常用的治療策略，既有利于降低卵巢過(guò)度刺激的風(fēng)險(xiǎn)，又避免了因一些近期不良因素（如宮腔、盆腔、免疫等因素）導(dǎo)致的移植失敗和胚胎浪費(fèi)[3]。在凍胚移植周期，胚胎須經(jīng)歷冷凍復(fù)蘇過(guò)程，伴隨細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)的改變、細(xì)胞器的移位與復(fù)位、細(xì)胞脫水與復(fù)水等過(guò)程[4]。所以，冷凍復(fù)蘇后的胚胎往往對(duì)不良培養(yǎng)環(huán)境更加敏感，需要選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)環(huán)境以保證胚胎正常的結(jié)構(gòu)與活力的恢復(fù)[5]。

蛋白添加物是臨床胚胎實(shí)驗(yàn)室中常用的培養(yǎng)液成分，但不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)蛋白添加物的種類(lèi)和添加濃度的選擇上仍存在著較大差異，尤其是在囊胚培養(yǎng)和胚胎移植液中。文獻(xiàn)資料顯示，不同實(shí)驗(yàn)室在移植前培養(yǎng)液中使用的蛋白濃度范圍從2.5%至50%不等，但考慮到安全性問(wèn)題，絕大多數(shù)將濃度控制在10%以下[6]。但具體哪種蛋白濃度最優(yōu)尚缺乏數(shù)據(jù)支持，僅有的研究也只是分析了不同蛋白濃度對(duì)新鮮胚胎移植結(jié)局的影響[6]，尚無(wú)對(duì)凍胚移植影響的報(bào)道。

本研究首次探討了兩種臨床上最常用的蛋白添加物濃度（5%和10%）對(duì)凍胚復(fù)蘇移植后臨床結(jié)局的影響。結(jié)果顯示，兩組hCG陽(yáng)性率、生化妊娠、臨床妊娠、流產(chǎn)、繼續(xù)妊娠、胚胎著床、多胎數(shù)和異位妊娠指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＞0．05），這與以往針對(duì)新鮮胚胎移植的報(bào)道相一致[6]，但這是否與研究病例較少（最終病例數(shù)僅60例）有關(guān)尚需更多的數(shù)據(jù)支持。考慮到高蛋白組的胚胎著床率較低蛋白組低10%，本研究及時(shí)終止了試驗(yàn)。未來(lái)將采取觀察性研究，如多中心隊(duì)列或病例對(duì)照研究來(lái)分析不同蛋白濃度組之間凍胚移植結(jié)局的差異。