肝癌衍化生長(zhǎng)因子對(duì)大腸癌早期血管形成的調(diào)節(jié)作用研究

喬鎮(zhèn) 金牡丹 周嘉鶴 沈忠

大腸癌的發(fā)病率在全球常見(jiàn)惡性腫瘤中排第4位[1]。近年來(lái)，我國(guó)大腸癌病死率呈上升趨勢(shì)[2]。根據(jù)大腸癌發(fā)病危險(xiǎn)因素采取相應(yīng)的干預(yù)措施，對(duì)降低大腸癌發(fā)病率和提高早期診斷率有重要意義[3]。肝癌衍化生長(zhǎng)因子（hepatoma-derived growth factor，HDGF）是一種最初從條件培養(yǎng)的Huh-7肝癌細(xì)胞系中提取出來(lái)肝素結(jié)合蛋白[4-5]。HDGF可能通過(guò)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的產(chǎn)生促進(jìn)血管生成，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。許多體外腫瘤細(xì)胞系、原發(fā)細(xì)胞（血管平滑肌和血管內(nèi)皮細(xì)胞）[6]及體內(nèi)多種腫瘤細(xì)胞，如胃癌[7]、膽囊癌[8]、胰腺癌[9]、食管癌[10]、腎癌[11]、肺癌[12]細(xì)胞等均可表達(dá) HDGF，誘導(dǎo)腫瘤血管形成，促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展。微血管密度（microvessel density,MVD）是反映腫瘤血管形成程度的指標(biāo)，也是影響結(jié)腸癌預(yù)后的因素之一[13]。基于此，本研究旨在探討HDGF在大腸癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中對(duì)血管形成的調(diào)節(jié)作用及其在大腸癌早期診斷中的意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本 選取2010至2012年在杭州市第三人民醫(yī)院行手術(shù)切除治療的50例大腸癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁正常腸黏膜組織（距癌周＞10cm）標(biāo)本。所有病例手術(shù)前均未接受放射、化學(xué)治療及免疫抑制劑治療，其中男32 例，女 18 例；年齡 27～83（56.35±29.2）歲。另?yè)裢谠诤贾菔械谌嗣襻t(yī)院行結(jié)腸鏡下摘除術(shù)的25例腺瘤性息肉組織標(biāo)本。所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查確診，液氮冷存后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。

1.2 試劑和儀器 鼠抗人VEGF單克隆抗體、鼠抗人CD34單克隆抗體、sunpoly-HII/HRP兔、鼠通用型試劑盒均采購(gòu)自上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司，兔抗人HDGF單克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。TRIzol試劑、HDGF、GAPDH引物均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，熒光定量試劑、多聚胸腺嘧啶引物購(gòu)自日本Takara公司。PCR引物由上海英駿生物公司合成。GAPDH正義鏈∶5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，反義鏈∶5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。 HDGF 正 義 鏈 ∶5′-GAGGGTGACGGTGATAAGAA-3′，反義鏈∶5′-GAAACATTGGTGGCTACAGG-3′。臺(tái)式離心機(jī)為美國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品，實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品，PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)Applide Biosystem公司產(chǎn)品，2100生物分析儀為德國(guó)Agilent公司產(chǎn)品。其余實(shí)驗(yàn)材料及試劑取自杭州市第三人民醫(yī)院病理中心實(shí)驗(yàn)室。

1.3 方法

1.3.1 HDGF、VEGF蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法。制備大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織標(biāo)本的3μm連續(xù)切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，高溫高壓抗原修復(fù)；SP法染色（按說(shuō)明書(shū)操作），DAB顯色，蘇木精復(fù)染；脫水、透明、封片。采用已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照，PBS分別代替 HDGF、VEGF、CD34單克隆抗體作為陰性對(duì)照。HDGF蛋白以細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞核著棕黃色為陽(yáng)性染色，≥90%的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均為陽(yáng)性染色為表達(dá)陽(yáng)性。VEGF蛋白以細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞核著棕黃色為陽(yáng)性染色，每張切片陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥10%為表達(dá)陽(yáng)性。

1.3.2 MVD檢測(cè) 用抗體CD34標(biāo)記新生血管，每張切片首先在低倍鏡（×100）下挑選MVD最高的區(qū)域，然后再高倍鏡（×400）下，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野的被CD34染成棕黃色的血管數(shù)目，取平均值作為該病例的MVD值。

1.3.3 HDGF mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用熒光定量RT-PCR法。受經(jīng)費(fèi)限制，采用隨機(jī)數(shù)字表法選取大腸癌及對(duì)應(yīng)正常腸黏膜組織標(biāo)本、腺瘤組織標(biāo)本各10例進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè)。大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織的總RNA提?。喝〗M織標(biāo)本約100mg研磨至粉末，加入TRI－zol裂解液1ml混勻，轉(zhuǎn)入1.5ml EP管。每升TRIzol加氯仿0.2 L，緊閉離心管，劇烈搖蕩15s，室溫放置2min，離心（4°C，30min）；取上層水相轉(zhuǎn)入新的離心管，等比例加入異丙醇，上下顛倒10次后，-20°C沉淀30min以上，離心（4°C，30min）；棄上清液，加入 1ml的 75%乙醇溶液，混勻，再次離心（4°C，10min）；棄上清液，超凈臺(tái)內(nèi)室溫干燥10min。將RNA溶于30μl RNase-free水中，-80°C保存。取1μl，利用Agilent 2100觀察RNA質(zhì)量，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定抽提RNA濃度、純度。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA和實(shí)時(shí)qPCR反應(yīng)：取1μg總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA的合成。RT-PCR法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)各模板的Ct值。以正常腸黏膜組織GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算大腸癌、腺瘤組織的ΔΔCt值。采用 2-ΔΔCt法計(jì)算大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織HDGF mRNA表達(dá)水平。

1.4 觀察指標(biāo) （1）比較大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織HGDF、VEGF蛋白表達(dá)情況及MVD；（2）分析大腸癌組織HDGF、VEGF蛋白表達(dá)情況與MVD的關(guān)系；（3）比較大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織HDGF mRNA表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織HGDF蛋白表達(dá)情況比較 大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織HGDF蛋白表達(dá)陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），大腸癌組織HDGF蛋白表達(dá)陽(yáng)性率最高，達(dá)80.0%，正常腸黏膜組織僅為8.0%，腺瘤組織介于兩者之間，為72.0%，見(jiàn)圖 1、表 1。

圖1 大腸癌組織HDGF蛋白表達(dá)情況（SP法染色；a:×100；b:×400）

2.2 大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織VEGF蛋白表達(dá)情況比較 大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織VEGF蛋白表達(dá)陽(yáng)性率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），大腸癌組織VEGF蛋白表達(dá)陽(yáng)性率最高，為86.0%，腺瘤組織為40.0%，正常腸黏膜組織最低，為4.0%，見(jiàn)圖2、表2。

表1 大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織HGDF蛋白表達(dá)情況比較[例（%）]

圖2 大腸癌組織VEGF蛋白表達(dá)情況（SP法染色；a:×100；b:×400）

表2 大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織VEGF蛋白表達(dá)情況比較[例（%）]

2.3 大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織MVD比較 大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織MVD分別為25.28±4.14、15.24±4.73、12.48±5.81，3 者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。大腸癌、腺瘤組織MVD均高于正常腸黏膜組織（均P＜0.05），大腸癌組織MVD亦高于腺瘤組織（P＜0.05）。

2.4 大腸癌組織HDGF、VEGF蛋白表達(dá)情況與MVD的關(guān)系分析 HDGF陽(yáng)性表達(dá)的大腸癌組織MVD為26.29±3.43，陰性表達(dá)的為 21.60±2.36。VEGF 陽(yáng)性表達(dá)的大腸癌組織MVD為26.22±3.16，陰性表達(dá)的為20.00±2.64。HDGF、VEGF蛋白陽(yáng)性表達(dá)者M(jìn)VD均高于陰性表達(dá)者（均P＜0.05）。

2.5 大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織HDGF mRNA表達(dá)水平比較 見(jiàn)表3。

表3 大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織HDGFmRNA表達(dá)水平比較

由表3可見(jiàn)，大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織HDGF mRNA表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），大腸癌組織HDGF mRNA表達(dá)水平高于腺瘤、正常腸黏膜組織（均P＜0.05），腺瘤組織HDGF mRNA表達(dá)水平高于正常腸黏膜組織（P＜0.05）。

3 討論

大腸癌一直是發(fā)病率位居前列的國(guó)民常見(jiàn)惡性腫瘤之一[14]，早期篩查、診斷大腸癌對(duì)改善患者預(yù)后意義重大。HDGF是一種肝素結(jié)合蛋白，最初是從條件培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞系中提取出來(lái)的。研究發(fā)現(xiàn)，HDGF與多種消化道腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、預(yù)后有關(guān)。HDGF在腫瘤的血管形成中起重要作用，作為一種促有絲分裂原，其具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)新生血管形成的作用。HDGF參與了血管形成過(guò)程，以及多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，其機(jī)制可能是HDGF具有與DNA結(jié)合的功能，可參與細(xì)胞增殖、分化，從而導(dǎo)致腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果顯示，大腸癌組織HDGF表達(dá)陽(yáng)性率和MVD均高于腺瘤、正常腸黏膜組織，在大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織中呈遞減趨勢(shì)，這提示HDGF的高表達(dá)可能與大腸癌的癌前病變有關(guān)，參與大腸癌的早期病理改變。本研究還發(fā)現(xiàn)，HDGF陽(yáng)性表達(dá)的大腸癌組織MVD明顯高于陰性表達(dá)者，這說(shuō)明HDGF可促進(jìn)大腸癌新生血管形成，參與腫瘤的血行轉(zhuǎn)移，為其提供條件。而腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移對(duì)患者的預(yù)后起關(guān)鍵作用，發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤患者預(yù)后不良。

VEGF是目前已知的關(guān)鍵的促進(jìn)血管形成的因子之一，在腫瘤的血管形成過(guò)程中起重要作用，涉及各個(gè)系統(tǒng)腫瘤[15]。本研究觀察到，大腸癌組織VEGF表達(dá)陽(yáng)性率高于腺瘤、正常腸黏膜組織，在大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織中亦呈遞減趨勢(shì)，這表明VEGF的高表達(dá)參與促進(jìn)腫瘤的早期發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，HDGF可誘導(dǎo)VEGF表達(dá)，抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子中和抗體可抑制過(guò)度表達(dá)HDGF的腫瘤的生長(zhǎng)[6]。

此外，本實(shí)驗(yàn)又從分子生物學(xué)角度分析并比較了大腸癌、腺瘤、正常腸黏膜組織HDGF mRNA表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大腸癌組織HDGF mRNA表達(dá)水平高于腺瘤、正常腸黏膜組織，腺瘤組織HDGF mRNA表達(dá)水平高于正常腸黏膜組織。這提示臨床可以HDGF mRNA為觀察指標(biāo)，以RT-PCR為輔助檢查手段，幫助大腸癌的早期診斷。RT-PCR是一種經(jīng)濟(jì)有效的體外擴(kuò)增技術(shù)，取少量的標(biāo)本即可進(jìn)行成倍擴(kuò)增表達(dá)，如將此技術(shù)應(yīng)用于臨床大腸癌早期診斷，有助于指導(dǎo)臨床的早期治療，改善患者預(yù)后。

綜上所述，HDGF在大腸癌組織中高表達(dá)，通過(guò)與VEGF協(xié)同作用，促進(jìn)大腸癌早期血管形成。HDGF表達(dá)在大腸癌惡變過(guò)程中呈遞增趨勢(shì)，以其為檢測(cè)指標(biāo)有助于大腸癌的早期診斷。