γ氨基丁酸(GABA)形成機(jī)理及富集方法的研究進(jìn)展

王凱凱,孫 朦,宋佳敏,王鴻飛,邵興鋒,李和生,周文化,許 鳳,*

(1.寧波大學(xué)食品科學(xué)與工程系,浙江寧波 315211;2.特醫(yī)食品加工湖南省重點實驗室,湖南長沙 410004)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)分子式為C4H9NO2,相對分子量103.2,是一種四碳、非蛋白氨基酸,在脊椎動物、植物和微生物中廣泛存在[1]。GABA作為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)起到分子信號的作用,具有多種生理功能[2]。研究表明,GABA不僅具有降低神經(jīng)元活性、防止神經(jīng)細(xì)胞過熱以及降低血壓的作用,還具有防止動脈硬化、調(diào)節(jié)心律失常、降低血脂、增強(qiáng)肝功能等生理功效[3]。而且,GABA對癲癇、驚厥、亨廷頓病和帕金森病等多種精神疾病具有一定的療效作用[1,4-5]。盡管GABA具有重要的生理功能,但隨著人們壓力的增大和年齡的增長,人體中的GABA含量日益減少。因此,從食物中補充GABA對人體健康意義重大。植物組織中GABA的含量極低,通常在0.3～32.5 μmol/g之間[6],不能滿足人體的生理需求。已有文獻(xiàn)報道,植物中GABA富集與植物所經(jīng)歷脅迫應(yīng)激反應(yīng)有關(guān),在受到缺氧、熱激、冷激、機(jī)械損傷、鹽脅迫等脅迫壓力時,會導(dǎo)致GABA的迅速積累[7-11]。對植物性食品原料采用某種脅迫方式處理后,或通過微生物發(fā)酵作用使其體內(nèi)GABA含量增加,用這種原料加工成富含GABA的功能產(chǎn)品已成為研究熱點[12]。近年來,GABA作為一種新型功能性因子,已被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)領(lǐng)域。利用富含GABA的發(fā)芽糙米[13]、大豆[14]和蠶豆[15]等原料開發(fā)的食品已面市。本文對GABA形成機(jī)理及富集方法的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述,為富含GABA產(chǎn)品的開發(fā)研究提供參考。

1 GABA形成機(jī)理

1.1 植物本身代謝途徑

在植物體中有兩條GABA合成和轉(zhuǎn)化途徑:一條是谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)催化谷氨酸脫羧合成GABA,稱為GABA支路(GABA shunt)(如圖1)[16];另一條是由多胺降解產(chǎn)物轉(zhuǎn)化形成GABA,稱為多胺降解途徑(polyamine degradation pathway)(如圖2)[17]。

圖1 GABA支路Fig.1 GABA shunt

圖2 多胺降解途徑Fig.2 Polyamine degradation pathway

1.1.1 GABA支路 在高等植物中,GABA的代謝主要由三種酶參與完成,首先在GAD作用下,L-谷氨酸(glutamic acid,Glu)在α-位上發(fā)生不可逆脫羧反應(yīng)生成 GABA,然后在GABA 轉(zhuǎn)氨酶(GABA transaminase,GABA-T)催化下,GABA與丙酮酸和α-酮戊二酸反應(yīng)生成琥珀酸半醛,最后經(jīng)琥珀酸半醛脫氫酶(succinic semialdehyde dehydrogenase,SSADH)催化,琥珀酸半醛氧化脫氫形成琥珀酸最終進(jìn)入三羧酸循環(huán)(krebs circle)。這條代謝途徑構(gòu)成了TCA循環(huán)的一條支路,稱為GABA支路[17]。Ludewig等[18]敲除擬南芥中調(diào)控琥珀酸半醛脫氫酶表達(dá)的基因后再對其進(jìn)行光線和熱激處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn),擬南芥中活性氧和GABA得到了顯著提高,此結(jié)果進(jìn)一步證實植物中GABA支路的存在。在植物中,存在于細(xì)胞質(zhì)中GAD和線粒體中的GABA-T、SSADH共同調(diào)節(jié)GABA支路代謝,其中GAD是合成GABA的限速酶[19]。植物GAD含有鈣調(diào)蛋白(CaM)結(jié)合區(qū),GAD活性不僅受Ca2+和H+濃度的共同調(diào)控[20],還受到GAD輔酶-磷酸吡哆醛(PLP)以及底物谷氨酸濃度的影響[21]。這種雙重調(diào)節(jié)機(jī)制將GABA的細(xì)胞積累與環(huán)境脅迫的性質(zhì)和嚴(yán)重程度聯(lián)系起來。冷激、熱激、滲透脅迫和機(jī)械損傷均會提高細(xì)胞液中Ca2+濃度,Ca2+與CaM結(jié)合形成Ca2+/CaM復(fù)合體,在正常生理pH條件下能夠刺激GAD基因表達(dá),提高GAD活性;而酸性pH刺激GAD的出現(xiàn)是由于應(yīng)激降低細(xì)胞的pH,減緩細(xì)胞受到酸性危害[22]。植物中GABA支路被認(rèn)為是合成GABA的主要途徑[23]。目前,大多數(shù)研究集中在如何提高GAD活性實現(xiàn)GABA富集。

1.1.2 多胺降解途徑 多胺(polyamine,PAs)包括腐胺(putrescine,Put)、精胺(spermine,Spm)和亞精胺(spermidine,Spd),其中以腐胺作為多胺生物代謝的中心物質(zhì)[24]。多胺降解途徑是指二胺或多胺(PAs)分別經(jīng)二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)和多胺氧化酶(polyamine oxidase,PAO)催化產(chǎn)生4-氨基丁醛,再經(jīng)4-氨基丁醛脫氫酶(4-amino aldehyde dehydrogenase,AMADH)脫氫生成GABA的過程,多胺降解途徑最終與GABA支路交匯后參與TCA循環(huán)代謝[16]。其中二胺氧化酶和多胺氧化酶是分別催化生物體內(nèi)Put和 Spd、Spm降解的關(guān)鍵酶。蠶豆發(fā)芽期間,厭氧脅迫可誘導(dǎo)多胺合成的關(guān)鍵性酶活性的提高,促進(jìn)多胺的積累,同時多胺氧化酶活性也隨之提高,通過多胺降解途徑促進(jìn)了GABA的合成與積累,提高了蠶豆的抗逆境能力[15]。研究表明,大豆根中游離多胺含量在鹽脅迫下增加,DAO活力提高,GABA富集量增加11～17倍[25]。盡管多胺降解途徑被認(rèn)為是合成GABA的另一條重要途徑,但其在單子葉植物中合成GABA的能力遠(yuǎn)低于GABA支路。目前,對于多胺降解途徑的研究多集中在豆類等雙子葉植物上,且其貢獻(xiàn)率在30%左右[26]。

1.2 微生物代謝途徑

在微生物中,GABA代謝是通過GABA支路完成的,利用微生物體內(nèi)較高的GAD活性,將Glu脫羧形成GABA,然后在GABA-T、SSADH作用下,GABA進(jìn)入下游的分解過程生成琥珀酸半醛、琥珀酸參與微生物的生理代謝[26]。微生物富集GABA就是通過對培養(yǎng)基的優(yōu)化以及菌株的改良使其具有較高的GAD活性,增加GABA合成率,降低分解率來實現(xiàn)的。目前,大量研究已證明GAD在原核到真核微生物中都有存在,此外,利用微生物中GAD脫羧形成GABA不受資源、環(huán)境和空間的限制,與其他方法相比具有顯著的優(yōu)勢[27]。

2 GABA富集方法

2.1 植物富集法

在高等植物中,GABA富集與逆境條件下應(yīng)激反應(yīng)有關(guān),包括機(jī)械損傷、低溫脅迫、高溫脅迫和鹽脅迫等。實驗表明,不同逆境脅迫條件引起植物體中GABA達(dá)到最大值所需要的時間以及含量的增加程度均會有所不同[22,26],這表明不同逆境脅迫誘導(dǎo)GABA積累機(jī)制有所不同。Kinnersley[22]認(rèn)為,外界脅迫處理引起植物組織中GABA積累的可能機(jī)制主要有三方面:Ca2+的作用,H+的作用以及底物水平的變化。鹽脅迫,低溫和高溫脅迫等逆境條件通過增加Ca2+的濃度,進(jìn)而影響GAD活性,從而導(dǎo)致GABA在植物體內(nèi)富集;而機(jī)械損傷和低氧脅迫積累GABA的機(jī)制可能是通過增加細(xì)胞質(zhì)中H+濃度,激活GAD從而達(dá)到GABA富集;在三羧酸循環(huán)過程中,會導(dǎo)致有機(jī)酸的積累,提高了谷氨酸等底物的含量,進(jìn)而導(dǎo)致GABA含量的增加。在逆境脅迫下,植物通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)水平使細(xì)胞對其所處的脅迫環(huán)境迅速產(chǎn)生感應(yīng),同時其相關(guān)酶的活性發(fā)生變化,除此之外,植物內(nèi)源性滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(GABA、Glu和PAs等)含量也會增加,以應(yīng)對脅迫環(huán)境,提高植物的抗逆性[28]。

2.1.1 鹽脅迫 鹽脅迫條件下植物除提高可溶性物質(zhì)含量以及抗氧化酶活力用以抵抗鹽的滲透脅迫外,還會提高GABA代謝水平以此提高植物的耐鹽性[28]。玉米幼苗經(jīng)200 mmol/L NaCl處理,其GAD活性得到了明顯提高,導(dǎo)致GABA的積累。此外,研究發(fā)現(xiàn)玉米幼苗根中GABA富集不僅早于莖和葉且含量也顯著高于莖和葉,這說明在NaCl脅迫條件下通過提高GAD活性促進(jìn)GABA的積累,且玉米幼苗的不同部位對鹽脅迫感受強(qiáng)度也有所不同,影響GABA富集水平和富集時間[29]。對發(fā)芽過程中的五種小麥(Hurani 75、Sham I、Acsad 6、Um Qayes 和Nodsieh)進(jìn)行NaCl處理,結(jié)果表明,在鹽脅迫條件下,五種小麥中的gad基因表達(dá)量均有所增加,GABA含量得到提高,其中Um Qayes 在NaCl脅迫下GAD表達(dá)量最多,GABA積累最多[30]。番茄果實經(jīng)50、100 mmol/L NaCl處理后,GABA含量分別是對照組的1.4、1.7倍,其果實重量降低,這表明植物可以通過GABA代謝增強(qiáng)其對鹽脅迫的抗性[31]。Akcay等[32]在研究野生型、突變體煙草(CMSII)經(jīng)鹽脅迫處理后GABA代謝變化時發(fā)現(xiàn),野生型煙草在鹽脅迫下,gad基因表達(dá)量顯著提高,GAD活性增強(qiáng),GABA含量顯著增加,CMSII中無顯著變化,而兩種煙草經(jīng)長期(7～21 d)鹽脅迫其GABA含量均顯著提高,表明GABA富集受到鹽脅迫處理時間的影響。目前,大多數(shù)研究主要分析在鹽脅迫條件下,GABA支路與GABA富集之間的關(guān)系,而對此條件下多胺降解途徑對GABA富集的作用缺乏系統(tǒng)性研究。

2.1.2 低氧脅迫 溶液中氧氣濃度與空氣中相比較低,將植物樣品浸泡在溶液中可以形成一個低氧環(huán)境,從而以達(dá)到富集GABA的目的。在低氧條件下,植物的電子傳遞鏈被抑制,糖類物質(zhì)主要通過糖酵解途徑大量生成丙氨酸,進(jìn)而積累乙醇和乳酸,導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)酸化。細(xì)胞質(zhì)中參與GABA合成限速酶GAD可在酸性環(huán)境下激活,GAD催化谷氨酸脫羧生成GABA的過程需H+參與,最適pH一般為5.5～6.0[28]。對采后草莓“Jewel”進(jìn)行CO2(20%)處理,結(jié)果表明,草莓受到CO2脅迫壓力后,其代謝產(chǎn)物(乙醇和乙酸乙酯)含量增加,GAD活性無明顯差異,但GABA-T活性低于對照組,GABA降解率降低,導(dǎo)致GABA含量增加[33]。西紅柿進(jìn)行CO2(10%)處理,結(jié)果表明,經(jīng)CO2處理gaba-t和ssadh基因表達(dá)量沒有顯著性差異,gad2和gad3基因表達(dá)量得到了顯著性提高,而GABA-T活性降低,導(dǎo)致GABA分解率較低,GABA含量增加;且未完全成熟的西紅柿經(jīng)CO2處理,GAD活性高于成熟組,而GABA-T低于成熟組,其GABA含量高于成熟的西紅柿,這表明在缺氧條件下GABA富集與果實的成熟度有關(guān)[34]。沈強(qiáng)等[35]對新鮮茶葉先采用真空氮氣厭氧處理然后再進(jìn)行除氮充氧,茶葉中GABA含量達(dá)到1.86 mg/g,但茶葉中的香氣成分少于對照樣,品質(zhì)有所下降。Liao等[36]在對野茶樹的鮮茶葉進(jìn)行缺氧處理時發(fā)現(xiàn),缺氧環(huán)境提高了腐胺和精胺含量,GAD基因(CsGAD1 和CsGAD2)表達(dá)出現(xiàn)上調(diào),GAD和DAO活性得到提高,GABA含量達(dá)到0.73 mg/g FW,是對照組的20倍。蠶豆在發(fā)芽期間進(jìn)行缺氧處理,豆胚中Glu和多胺含量顯著性增加,GAD和DAO被激活,GABA含量達(dá)到了16 mg/g DW,是對照組的8.26倍,且多胺降解途徑合成GABA的貢獻(xiàn)約為30%[15]。低氧聯(lián)合其他脅迫方式會進(jìn)一步提高GABA的富集水平,一般低氧條件結(jié)合鹽脅迫處理會使GABA富集水平進(jìn)一步提高[29]。對缺氧條件下的發(fā)芽大豆分別聯(lián)合NaCl、CaCl2處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn),聯(lián)合處理組與只進(jìn)行缺氧處理相比,GABA含量得到進(jìn)一步提高,分別達(dá)到4.0、3.3 g/kg DW[26]。在國內(nèi),利用缺氧脅迫方式富集GABA的研究多集中在茶葉發(fā)酵以及豆類發(fā)芽等過程中,且對多胺降解途徑不夠深入。國外研究者通過氣調(diào)的方式達(dá)到低氧高二氧化碳的環(huán)境,既能達(dá)到果蔬的保鮮作用又可以實現(xiàn)其體內(nèi)GABA富集,為果蔬保鮮和GABA富集提供了一種新的思路。

2.1.3 機(jī)械損傷 植物受到機(jī)械損傷會破壞正常的細(xì)胞分區(qū),使細(xì)胞質(zhì)中的H+和Ca2+水平的增加,刺激GABA合成酶的活性,從而實現(xiàn)GABA的富集,抵御細(xì)胞所受到的逆境危害[22]。植物遭到植食性昆蟲的啃食后可造成一定程度的機(jī)械損傷,研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)昆蟲啃食后的植物葉片,其中GABA含量顯著性增加以抵抗昆蟲對植物的進(jìn)一步啃食傷害[37]。植物遭受昆蟲咬傷后,植物防偽系統(tǒng)可通過刺激gad基因超表達(dá),GAD活性提高,GABA合成率大于分解率,實現(xiàn)GABA富集[38]。Petrivalsky等[39]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)豌豆受到機(jī)械損傷后,4-氨基丁醛脫氫酶(AMADH)活性得到提高,且多胺含量、GABA含量增加,這表明AMADH可能對GABA含量增加有直接的貢獻(xiàn)。目前,大多數(shù)研究主要集中在機(jī)械損傷后對產(chǎn)品品質(zhì)的影響,如鮮切處理對植物中酚類物質(zhì)含量和抗氧化活性的提高,而對GABA代謝研究鮮有報道。研究機(jī)械損傷脅迫下GABA代謝,并從分子角度進(jìn)一步確定機(jī)械損傷脅迫在GABA積累中的作用將成為研究熱點。

2.1.4 低溫脅迫 低溫脅迫條件下植物細(xì)胞發(fā)生一系列生理變化,包括植物細(xì)胞中碳水化合物、氨基酸含量的增加[40]。溫度的迅速降低會導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)的區(qū)室化現(xiàn)象加強(qiáng),激活細(xì)胞質(zhì)中GAD,從而提高植物中 GABA 含量,增強(qiáng)植物對低溫逆境的抵抗作用,保護(hù)植物免受低溫?fù)p害[41]。植物細(xì)胞質(zhì)中有可能存有Ca2+逆境下的專有途徑,低溫可促使細(xì)胞中Ca2+釋放,并且低溫脅迫會使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生較大的冰晶體,對細(xì)胞膜系統(tǒng)具有顯著的損害作用,會使Ca2+、H+等滲入細(xì)胞質(zhì)激活細(xì)胞質(zhì)中的鈣調(diào)素結(jié)合區(qū)域,提高鈣調(diào)蛋白表達(dá)水平,從而激活谷氨酸脫羧酶活性催化谷氨酸降解形成GABA,促進(jìn)GABA積累[42]。菠菜置于低溫環(huán)境中,其體內(nèi)的蔗糖、抗壞血酸、脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸以及GABA含量增加,提高了菠菜的營養(yǎng)價值[43]。劉暢等[44]選取大豆為原料,利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化出大豆中GABA最佳的富集工藝條件。結(jié)果表明,當(dāng)冷凍溫度為-33.04 ℃、解凍溫度為33.02 ℃、冷凍時間為19.08 h、解凍時間為19.70 h時,GABA含量達(dá)到11.67 mg/g。對萌發(fā)大豆進(jìn)行凍融培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn),經(jīng)過凍融培養(yǎng)的大豆新芽中GAD、DAO活性提高,GABA含量增加,達(dá)到2.34 mg/g DW,是未進(jìn)行凍融培養(yǎng)嫩芽的7.21倍,這說明低溫凍融處理可以激活GABA支路和多胺降解途徑中關(guān)鍵酶,使GABA含量增加[45]。馬麗等[46]以優(yōu)質(zhì)“長粒香”糙米為實驗材料,采用正交實驗優(yōu)化出在低溫脅迫下發(fā)芽糙米中GABA的最佳工藝條件,結(jié)果表明,當(dāng)?shù)蜏孛{迫溫度為0 ℃,脅迫時間為2 h,發(fā)芽時間為30 h時,GABA含量最高,為0.3516 mg/g。

2.1.5 高溫脅迫 高溫脅迫是指環(huán)境溫度高于植物正常生長溫度所造成的一種植物應(yīng)激現(xiàn)象,主要有熱激(短時間熱處理)和干燥(長時間熱處理)。在42 ℃高溫誘導(dǎo)下,玉米幼苗內(nèi)源GABA含量升高,處理48 h時達(dá)到最大,且GABA對玉米幼苗抵抗高溫環(huán)境起著一定作用[47]。芝麻植株在50 ℃熱激2 h,其GABA含量與對照組相比提高13%,熱激后進(jìn)行室溫培養(yǎng),其GABA含量增加到21%,這表明植物中GABA富集與其所處環(huán)境溫度密切相關(guān)[48]。將插入T-DNA(影響擬南芥中鈣調(diào)素基因的表達(dá))的擬南芥置于42 ℃進(jìn)行熱激處理2 h,結(jié)果發(fā)現(xiàn),擬南芥突變體cam5-4中GABA含量達(dá)到4.96 nmol/mg FW,是野生型的2倍,這可能是由于在高溫脅迫下突變體中鈣調(diào)蛋白的表達(dá)量提高,GAD被激活,最終導(dǎo)致GABA的積累[49]。擬南芥突變體pop2和野生型植株在42 ℃熱激0.5 h,GABA開始富集,熱激2 h,GABA含量得到顯著性增加,但突變體pop2中GABA含量低于野生型擬南芥,這可能是由于突變體pop2中的GABA-T功能受到損傷,使得GABA支路受到限制,為了維持細(xì)胞中C/N平衡,大量谷氨酸被分解,造成GABA底物濃度降低,從而導(dǎo)致GABA合成量減少[50]。目前,通過高溫脅迫方式實現(xiàn)GABA的富集主要是為了研究其與植物抗氧化以及自身保護(hù)之間的關(guān)系,多集中在植物生理學(xué)方面,而利用高溫方式對采后植物性原料進(jìn)行處理從而達(dá)到GABA富集的研究鮮有報道。

2.2 微生物發(fā)酵法

以谷氨酸及其鈉鹽(谷氨酸鈉)或富含谷氨酸的物質(zhì)為原料,利用大腸桿菌、曲霉菌、乳酸菌和酵母菌等微生物的發(fā)酵作用實現(xiàn)GABA富集的方法稱為微生物發(fā)酵法。微生物發(fā)酵法具有成本低、富集含量高的優(yōu)點[51]。利用微生物發(fā)酵富集GABA的研究己有文獻(xiàn)報道,在早期的研究中,以大腸桿菌為生產(chǎn)菌進(jìn)行微生物發(fā)酵富集GABA的研究較多,其原理是利用大腸桿菌體內(nèi)較高的GAD活性,將谷氨酸脫羧轉(zhuǎn)化為GABA[52]。利用大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)GABA具有發(fā)酵速度快、產(chǎn)量高的優(yōu)點,但其存在一定的安全隱患。近年來,一些安全性高的微生物,如乳酸菌、酵母菌、曲霉菌等用于GABA富集的研究已有報道[53-55]。

2.2.1 乳酸菌發(fā)酵法 乳酸菌是動物腸道內(nèi)正常菌群,對人體安全有利的食品微生物,已被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品的生產(chǎn)[55]。目前,已有文獻(xiàn)報道乳球菌屬(Lactococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)等一些乳酸菌具有合成 GABA的能力[14,56-57]。林謙等[58]對產(chǎn)GABA的乳酸菌(YS2)發(fā)酵條件進(jìn)行初步優(yōu)化并對優(yōu)化條件下的谷氨酸脫羧酶基因(gadB)進(jìn)行了純化,結(jié)果表明,在初始pH6.0,用牛肉膏和蛋白胨為氮源,用蔗糖為碳源的條件下發(fā)酵,GABA含量可達(dá)到5.68 g/L,與優(yōu)化前相比提高了30%,且此條件下純化后的GAD活性達(dá)到1.06 U/mg。利用乳酸菌對經(jīng)過冷激的紅豆進(jìn)行發(fā)酵處理時發(fā)現(xiàn),在37 ℃條件下發(fā)酵24 h,紅豆中GABA產(chǎn)量達(dá)到了682 mg/L,是未進(jìn)行發(fā)酵的20倍[59]。利用乳酸桿菌GABA100和雙歧桿菌BGN4對天麻粉進(jìn)行聯(lián)合發(fā)酵處理并對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明,在含有3%(W/V)L-谷氨酸、10%(W/V)冷凍天麻粉,初始 pH6.5的培養(yǎng)基中添加0.5%菌液在30 ℃條件下進(jìn)行聯(lián)合發(fā)酵6天,GABA產(chǎn)量為122.2 mmol/L[60]。夏江等[61]對乳酸菌株hjxj-01進(jìn)行紫外和γ射線誘變處理得到一株突變菌株 hjxj-08119,在含5%的L-谷氨酸鈉的GYP培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d,此菌株的GABA最大積累可達(dá)到17 g/L,相對于hjxj-01提高142.9%。吳非等[62]對保加利亞乳桿菌L2進(jìn)行紫外誘變處理得到高產(chǎn)GABA的菌株L2-4,其在含有1% L-谷氨酸培養(yǎng)基中的GABA產(chǎn)量為4.235 g/L,相對于原菌株的GABA產(chǎn)量提高了25.63%。由此可見,利用乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)GABA不僅可以通過優(yōu)化培養(yǎng)基實現(xiàn),也可以通過采用誘變育種的技術(shù)對菌株進(jìn)行改性以達(dá)到GABA富集目的[63]。利用乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)GABA具有產(chǎn)量高,安全性好的優(yōu)點,但其發(fā)酵速度慢,發(fā)酵周期比較長,適用于深層發(fā)酵。

2.2.2 酵母菌發(fā)酵法 酵母菌是一種含有大量氨基酸、蛋白質(zhì)的兼性厭氧菌,在發(fā)酵食品的生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛,其安全性較高,且具有較高的 GAD活性,是生產(chǎn)GABA的理想菌株,但目前對利用酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生GABA的研究比較少。李亞莉等[64]以近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)GPT-5-11為實驗菌株,在初始pH6.5,含有0.5%谷氨酸的培養(yǎng)基中37 ℃發(fā)酵48 h,GABA產(chǎn)量最高可達(dá)2.58 g/L。以遺傳穩(wěn)定高產(chǎn)GABA的酵母菌株為材料,對其產(chǎn)GABA的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明,在培養(yǎng)溫度為30 ℃,搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min,接種量為4%,培養(yǎng)時間為4 d時,發(fā)酵液中GABA含量達(dá)到了2.588 g/L,比優(yōu)化前提高了53%,為GABA工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)[65]。酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)GABA具有發(fā)酵速度快,安全性高等優(yōu)點,但其發(fā)酵產(chǎn)量相對較低。

2.2.3 曲霉菌發(fā)酵法 曲霉廣泛分布于谷物、空氣、土壤和各種有機(jī)物中,是發(fā)酵工業(yè)的重要菌種之一。Su等[66]選取曲霉CCRC 31615進(jìn)行固體發(fā)酵時發(fā)現(xiàn),向培養(yǎng)基中添加硝酸鈉、磷酸氫二鉀GABA產(chǎn)量分別達(dá)到1267.6、1493.6 mg/kg,這表明培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)會對菌株產(chǎn)GABA能力有所影響。對米曲霉3.800進(jìn)行紫外誘變處理,得到穩(wěn)定高產(chǎn)GABA的突變菌株3.800-4,然后分別在含有質(zhì)量濃度為10 g/L谷氨酸PDA綜合培養(yǎng)基和大豆-水的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)72 h,GABA產(chǎn)量分別達(dá)到4.491、0.874 g/L,相對與原菌株提高了23.58%、29.67%[67]。胡珊等[68]對20株產(chǎn)GABA紅曲菌種進(jìn)行了篩選并對高產(chǎn)菌株發(fā)酵工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明,高產(chǎn)菌MXL-8在含有2%大米粉、2.0%蛋白胨、1.5%酵母膏、0.15%硝酸鈉、0.15%磷酸二氫鉀和0.2%硫酸鎂的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 d,其GABA 的產(chǎn)量為22.373 mg/mL,為利用紅曲發(fā)酵生產(chǎn)富含GABA食品提供了實驗依據(jù)。曲霉發(fā)酵法生產(chǎn)GABA,其發(fā)酵速度較慢,產(chǎn)量相對較低,但其安全性較高。

2.2.4 混合菌發(fā)酵法 將不同種的菌株混合發(fā)酵生產(chǎn)GABA的方法稱為混合菌發(fā)酵法,其可以克服單一菌株發(fā)酵的缺點,GABA發(fā)酵產(chǎn)量高,具有較好的發(fā)展前景。利用紅曲菌M1、紅曲霉M2、釀酒酵母Sce01和乳酸菌Lac01四種菌株,以萌芽米為原料進(jìn)行混合發(fā)酵,結(jié)果表明,M1+M2+Sce01+Lac01組合在發(fā)酵溫度25 ℃、時間6 d、pH4.0、乳酸添加量為3%時發(fā)酵,GABA含量達(dá)到13.05 mg/g[69]。劉志強(qiáng)等[70]利用紅曲酶SM048、乳酸桿菌Lac.1在pH4～4.5、30 ℃的條件下進(jìn)行混合發(fā)酵,GABA產(chǎn)量為0.52 g/L,比SM048、Lac.1單獨發(fā)酵分別提高了147.62%和62.5%。

以上可知,不同菌株產(chǎn)GABA能力有所差異,有各自的優(yōu)缺點,但在實際生產(chǎn)中要求菌株必須滿足安全生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)。大腸桿菌雖然具有生長速度快,產(chǎn)量高等優(yōu)點,但其存在生產(chǎn)安全隱患故不常用于食品工業(yè);而乳酸菌、酵母菌以及霉菌等一些安全性較高的菌株正逐步應(yīng)用于食品工業(yè)領(lǐng)域。酵母菌和曲霉雖然生產(chǎn)GABA能力低,但其安全性較高,發(fā)酵速度快等優(yōu)點,通過利用現(xiàn)代誘變育種技術(shù)對其生產(chǎn)能力進(jìn)行提高,將會在食品生產(chǎn)得到廣泛應(yīng)用;乳酸菌不僅具有較高的生產(chǎn)安全性與較高GABA生產(chǎn)能力還具有免疫調(diào)節(jié),保持腸道菌群平衡等生理功能,因此利用乳酸菌發(fā)酵制備GABA還可發(fā)揮自身的益生效應(yīng)。但其發(fā)酵周期較長,可以利用基因技術(shù)對乳酸菌進(jìn)行改性克服其發(fā)酵周期長的缺點。此外,混合發(fā)酵法逐漸受到國內(nèi)外研究者的關(guān)注,混合發(fā)酵就是利用多種菌株的相互作用,通過不同代謝途徑的組合完成單一菌株不能單獨完成的復(fù)雜發(fā)酵過程。目前,對混合發(fā)酵的報道越來越多,混合發(fā)酵生產(chǎn)法GABA具有廣闊的研究前景。

3 結(jié)論與展望

GABA作為一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì),參與哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)活動,具有多重生理功能,對人體健康和保健具有積極作用。同時作為一種新型功能性因子,GABA已于2009年被國家衛(wèi)生部列在新食品原料終止審查名單中,其應(yīng)用前景受到廣泛關(guān)注,并已在食品、醫(yī)藥和化妝品得到應(yīng)用。GABA富集方法主要有植物富集法和微生物發(fā)酵法,其有各自的優(yōu)缺點。植物富集法具有成本高、產(chǎn)率低等缺點,但其安全性較好。微生物發(fā)酵法具有成本低、產(chǎn)量高等優(yōu)點,且不受空間、環(huán)境、資源的限制。微生物發(fā)酵生產(chǎn)GABA越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的重視,其中以乳酸菌發(fā)酵研究報道較多,生產(chǎn)技術(shù)較為成熟,此外,混合發(fā)酵法因其諸多優(yōu)點將會在今后的微生物發(fā)酵生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。目前,GABA形成機(jī)理以及影響富集的因素已初步探明,但大多數(shù)研究集中在GABA支路及其代謝酶方面,其代謝途徑的分子機(jī)制值得進(jìn)一步闡明,且多胺降解途徑也需要深入研究。